Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre ...

3. MATERIAL UND METHODEN
Im Anschluss an die Membranpräparation wurden je Präparationsstufe ein Ansatz und ein
entsprechender Blindwert nach folgendem Schema in Eppendorfcups pipettiert:
50 µl 0,5 M Tris–HCl - Lösung
50 µl 1,8 mM MgCl2 x 6 H2O-Lösung
50 µl verdünnte Probe
(je nach Probenkonzentration 1:20 – H, Ü14, Ü39 bzw. 1:50 - P14, P39, M, PM)
50 µl 10 mM 5’AMP als Substrat der Enzymaktivitätsmessung
bzw. 50 µl Reinstwasser als Probenblindwert
Nach einer kurzen Durchmischung wurden diese Ansätze bei 37°C für 30 Minuten inkubiert
und durch Zugabe von je 50 µl 1 M HCl abgestoppt. Danach wurden die so vorbereiteten
Proben folgendermaßen in Doppelansätzen in eine Mikrotiterplatte pipettiert:
In jede Kavität wurden 20 µl der verdünnten Probe (Ansatz s. o.) vorgelegt und 50 µl
Reinstwasser hinzugegeben. Kurz vor der Messung wurde eine Na-Molybdat/ 2,5 M HCl/
Malachitgrün-Lösung angesetzt und 180 µl je Ansatz hinzupipettiert.
Es folgte eine weitere Inkubation über 2 Minuten bei Raumtemperatur. Das freigesetzte
Phosphat resp. der Molybdat–Malachitgrün-Farbkomplex wurde in einem Photometer
(Spectra Rainbow, SLT) bei 620 nm gemessen.
Zur Ermittlung der Enzymaktivitäten musste parallel eine Standardkurve erstellt werden. Als
Standard wurden in identischen Ansätzen anstelle der Probe verschiedene definierte
Konzentrationen an Phosphat und statt des AMP Reinstwasser pipettiert.
Anhand der Geradengleichung aus der Standardkurve konnte unter Berücksichtigung des
Proteingehaltes die spezifische Aktivität der 5’NT in U/mg berechnet werden.
1 Unit = 1 µmol PO4 wird pro Minute durch 5’NT hydrolysiert.
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