Alpha-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre ...

3. MATERIAL UND METHODEN
3.7 Messung der Adrenozeptoren per Radioligand-Bindungsassay
3.7.1 Radioassay zur Bestimmung der α-adrenergen Rezeptoren
Die Messung der α-adrenergen Rezeptoren im equinen Fettgewebe wurden in Anlehnung an
die Methode von RE et al. (2001), eine Arbeitsgruppe, die α-Adrenozeptoren in der glatten
Muskulatur des equinen Ileums charakterisiert hat, durchgeführt.
Prinzip:
Bevor die Bestimmung der Rezeptoren begonnen werden konnte, musste der aktuelle
Proteingehalt der zuvor bei – 80°C gelagerten Plasmamembranfraktion ermittelt werden.
Hierzu wurden 2 Aliquots aus verschiedenen Aufarbeitungen eines Tieres auf Eis aufgetaut,
gepoolt und 50 µl zur Herstellung einer Verdünnung 1:10 abgenommen. Im Anschluss wurde
der Proteingehalt nach LOWRY (siehe 3.5) bestimmt, um für den Assayansatz eine
Proteinkonzentration von 1 mg/ml einstellen zu können.
Je nach aktuellem und benötigtem Proteingehalt wurden die Membranfraktionen nach dem
Auftauen durch Zentrifugation (20 min bei 31000 g) und Aufnahme des Pellets in einen
Tris-Puffer konzentriert oder entsprechend herunterverdünnt.
Genauere Angaben zu den im Folgenden verwendeten Agenzien sind auf Seite 75 im Anhang
aufgeführt. Die Bindungsassays wurden nach folgendem Schema im Doppelansatz pipettiert:
20 µl [ 3 H]Prazosin (0,148 kBq) bzw. [ 3 H]Rauwolszin (2,9 kBq) in Tris–Mg-Puffer
30 µl Phentolamin bzw. Tris–Mg–Puffer
50 µl Inkubationspuffer
100 µl Plasmamembranfraktion (100µg Protein)
[ 3 H]Prazosin und [ 3 H]Rauwolszin entsprechen spezifischen Radioliganden. [ 3 H]Prazosin
dient als selektiver Antagonist für α1–adrenerge Rezeptoren, [ 3 H]Rauwolszin hingegen als
selektiver Antagonist für α2-adrenerge Rezeptoren. Phentolamin entspricht einem
unspezifischen α-Rezeptorantagonisten und wird zur Bestimmung der Nichtspezifischen
Bindung eingesetzt. Zur Messung der Gesamtbindung wurde statt des Phentolamin die
entsprechende Menge an Tris–Mg-Puffer verwendet.
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