Untersuchungen zum Überflussmetabolismus in Escherichia coli

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Material und Methoden 25 5.7.2. Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. coli -Zellen Die Herstellung elektrokompetenter E. coli -Zellen (MG1655) erfolgte nach der Methode von Dower et al. (1988). Dazu wurde eine 6 ml SOB-Kultur von einer frischen LB-Platte angeimpft und bis zum Erreichen von einer OD 600 von 0,5 – 0,6 kultiviert. Die Zellen wurden kurz auf Eis gekühlt, durch Zentrifugation (5 min, 2650 g, 4 °C) sedimentiert und 3x mit 10 ml eiskaltem 10 % (v/v) Glycerin gewaschen. Danach wurden die Zellen in 60 µl 10 % (v/v) Glycerin aufgenommen und in 50 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Die Zellen wurden bis zu ihrer Verwendung bei – 70 °C gelagert. Für die Elektroporation wurde ein Aliquot der elektrokompetenten Zellen mit der zu transformierenden DNA vermischt und in eine vorgekühlte, sterile Elektroporationsküvette (Molecular BioProducts Inc., San Diego, USA) gegeben. Die Elektroporation erfolgt in einem BioRAD GENE Pulser TM (Biorad, München) bei einem Parallelwiderstand von 200 Ω, einer Spannung von 2,5 kV und einer Kondensatorkapazität von 25 µF. Direkt nach der Elektroporation wurde 1 ml SOB-Medium auf die Zellen gegeben, die Zellsuspension in ein 1,5 µl Reaktionsgefäß überführt und zur Regeneration und Ausprägung von Resistenzen 1 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen auf entsprechendem LB-Selektionsmedium ausplattiert. 5.8. Konstruktion von Deletionsmutanten Die Konstruktion von Deletionsmutanten erfolgte nach der Methode von Datsenko & Wanner (2000). Die Strategie dieser Methode beruht auf dem Austausch chromosomaler Sequenzen gegen eine Antibitikaresistenzkassette, welche zuvor mittels PCR generiert wurde. Der Austausch erfolgt dabei über homologe Rekombination und wird durch das Rekombinationssystem des Phagen λ ermöglicht, welches zu diesem Zweck in dem entsprechenden E. coli -Stamm plasmidkodiert (pKD46) exprimiert wird. Zur Deletion eines Gens oder Operons in E. coli MG1655 wurde zunächst die Kanamycinresistenzkassette des pKD13-Plasmids, welche von zwei FRT-Bindestellen (FLP recognition target) begrenzt wird, mittels PCR amplifiziert. Dazu wurden Primer verwendet, die eine etwa 50 bp lange Sequenz homolog zu den 5'- und 3'-flankierenden Bereichen der zu deletierenden Gene enthielten (s. Anhang). Die PCR-Produkte wurden mit dem PCR-Purification-Kit (Qiagen, Hilden) gereinigt, zum Entfernen nicht amplifizierter DNA mit DpnI verdaut und anschließend über ein präparatives Agarosegel erneut gereinigt. Anschließend erfolgte die Transformation elektrokompetenter MG1655 (pKD46)-Zellen mit dem linearen Deletionskonstrukt. Die
26 Material und Methoden Ansätze wurden auf LB-Medium mit Kanamycin ausplattiert. Positive Klone wurden selektioniert und der Austausch der chromosomalen Gensequenz gegen die Antibiotikaresistenzkassette mittels Kolonie-PCR überprüft. Später wurde die Resistenz-kassette in einem zweiten Rekombinationsschritt wieder entfernt. Dieser erfolgte mit Hilfe einer FLP- Rekombinase der Hefe, welche ebenfalls plasmidkodiert (pCP20) exprimiert wurde. Dazu wurden die E. coli -Stämme mit dem pCP20-Plasmid transformiert und zur Selektion positiver Klone auf LB-Medium mit Ampicillin ausplattiert. Die Eliminierung der Resistenz-kassette wurde ebenfalls mittels PCR nachgewiesen. Zur Entfernung der Plasmide pCP20 und pKD46, welche einen temperatursensitiven Replikationsursprung besitzen, wurden die Deletionsmutanten nochmals bei 37 °C kultiviert. Die Eliminierung der Plasmide wurde dadurch bestätigt, dass die Mutanten nicht mehr in der Lage waren, auf Medium zu wachsen, welches Ampicillin enthielt. 5.9. DNA-Sequenzierung und computergestützte Sequenzanalyse Die Sequenzierung von PCR-Produkten und klonierter DNA erfolgte nach dem Prinzip der Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977) und wurde von der Firma AGOWA GmbH durchgeführt. Zum Editieren der Sequenzdaten, zur Erstellung von Plasmidkarten und zur Analyse von Restriktionsschnittstellen wurde das Programm Clone Manager für Windows (Version 5.02, Scientific & Educational Software, Durham, USA) verwendet. Sequenzalignments wurden mit dem Programm BLAST2 des National Center of Biotechnology Information (NCBI, Washington, USA) durchgeführt. 6. Biochemische Methoden 6.1. Zellaufschluss und Fraktionierung 6.1.1. Herstellung von Enzymrohextrakten Zur Bestimmung von Enzymaktivitäten wurden die verschiedenen E. coli -Stämme unter aeroben Bedingungen im Fermenter kultiviert (s. Abschnitt 4.2.), die Zellen während der exponentiellen Phase (OD 600 0,50-0,64) durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zu ihrer Verwendung bei –70 °C gelagert. Später wurden Zellen aus 50 – 200 ml Kultur 2x mit dem jeweiligen Aufschlusspuffer gewaschen und anschließend in 1,5 ml
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