Untersuchungen zum Überflussmetabolismus in Escherichia coli

Material und Methoden 35
wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt und mit dem Mikrotiterplattenphotometer Spectra
Max Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) gemessen. Ein Testansatz enthielt 50 mM
Tris-Maleat-Puffer (12,1 g/l Tris; 11,6 g/l Maleinsäure, pH 6,8; eingestellt mit NaOH); 1 mM
ATP; 1 mM NAD + ; 1,5 U Hexokinase; 0,75 U Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 40 µl
Probe in einem Reaktionsvolumen von 300 µl. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mit
Hilfe einer Eichgeraden, die anhand verschiedener Glucose-Standardkonzentrationen (0,1-1,5
mM) und für jede Mikrotiterplatten-Messung neu erstellt wurde.
Die enzymatische Bestimmung der Essigsäurekonzentration in Kulturüberständen erfolgte
unter Verwendung eines Essigsäure-Testkits (R-Biopharm AG, Darmstadt) nach Beutler
(1984). Der Test beruht auf der Umsetzung von Essigsäure zu Acetyl-CoA durch das Enzym
Acetyl-CoA-Synthetase (ACS) in Gegenwart von ATP und Coenzym A (1). In einer
nachgeschalteten Reaktion wird das gebildete Acetyl-CoA in Gegenwart von Oxalacetat durch
die Citratsynthase (CS) unter Freisetzung von CoA zu Citrat kondensiert (2). Das für diese
Reaktion benötigte Oxalacetat wird von der L-Malatdehydrogenase (L-MDH) aus L-Malat in
Anwesenheit von NAD + gebildet (3).
ACS
(1) Acetat + ATP + Coenzym A Acetyl-CoA + AMP + P i
(2) Acetyl-CoA + Oxalacetat + H 2 O
CS
Citrat + Coenzym A
L-MDH
(3) L-Malat + NAD + Oxalacetat + NADH + H +
Dabei wird NAD + zu NADH reduziert, welches photometrisch bei 340 nm detektiert werden
kann und proportional zur Essigsäurekonzentration ist. Der Test wurde ebenfalls in
Mikrotiterplatten durchgeführt und mit dem Mikrotiterplattenphotometer Spectra Max Plus
(Molecular Devices, Sunnyvale, USA) gemessen. Dementsprechend wurde das Testvolumen
angepasst und auf 0,323 ml reduziert. Die einzelnen Testkomponenten wurden in den vom
Hersteller vorgegebenen Konzentrationen eingesetzt. Für den Test wurden die benötigten
Enzym- und Substratlösungen mit dem Puffer vermischt, auf die Mikrotiterplatte verteilt und
die Reaktion durch Zugabe von 40 µl Probe gestartet. Die Konzentrationsbestimmung
erfolgte mit Hilfe einer Eichgeraden, die anhand mehrerer Essigsäure-Standardkonzentrationen
(0,02-0,15 g/l) und für jede Mikrotiterplatten-Messung neu erstellt wurde.