Untersuchungen zum Überflussmetabolismus in Escherichia coli
Untersuchungen zum Überflussmetabolismus in Escherichia coli
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II<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
5.6. Polymerasekettenreaktion (PCR) …………………………………………………………. 238<br />
5.6.1. Kolonie-PCR ………………………………………………………………………….. 249<br />
5.7. Transformationstechniken …………………………………………………………………. 249<br />
5.7.1. Herstellung und Transformation chemisch kompetenter 9<br />
E. <strong>coli</strong>-Zellen ……………………………………………………………………….. 24 9<br />
5.7.2. Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. <strong>coli</strong>-Zellen 25 0<br />
5.8. Konstruktion von Deletionsmutanten …………………………………………………. 25 0<br />
5.9. DNA-Sequenzierung und computergestützte Sequenzanalyse ………………. 26 0<br />
6. Biochemische Methoden ………………………………………………………… 261<br />
6.1. Zellaufschluss und Fraktionierung …………………………………..…………………. 26 11<br />
6.1.1. Herstellung von Enzymrohextrakten …………………..………………….. 262<br />
6.1.2. Herstellung von Zellextrakten für die Prote<strong>in</strong>-Aff<strong>in</strong>itätsre<strong>in</strong>igung … 27 2<br />
6.2. Prote<strong>in</strong>bestimmung nach Bradford ……………………………………………………. 27 11<br />
6.3. Messung von Enzymaktivitäten …………………………………………………………. 28 1<br />
6.3.1. Bestimmung der Citratsynthase-Aktivität …………………………………. 28 1<br />
6.3.2. Bestimmung der α-Ketoglutaratdehydrogenase-Aktivität …….……. 11 28<br />
6.3.3. Bestimmung der Succ<strong>in</strong>yl-CoA-Synthetase-Aktivität ………………….. 29 12<br />
6.3.4. Bestimmung der Succ<strong>in</strong>atdehydrogenase-Aktivität ……………………. 29 12<br />
6.4. Fällung von Prote<strong>in</strong>en mit Trichloressigsäure (TCA) …………………………….. 30 13<br />
6.5. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ………………………………………………… 30 13<br />
6.5.1. Nachweis von Prote<strong>in</strong>en <strong>in</strong> Polyacrylamidgelen ……………………….. 30 13<br />
6.5.1.1. Kolloidale Coomassie-Färbung ………………………………… 13 30<br />
6.5.1.2. Silberfärbung …………………………………………………………. 14 30<br />
6.6. Re<strong>in</strong>igung von Prote<strong>in</strong>en ………………………………………………….…………..…. 31 14<br />
6.6.1. Aff<strong>in</strong>itätschromatographie mittels Dynabeads Streptavid<strong>in</strong> ………… 31 14<br />
6.7. MALDI-TOF-Massenspektrometrie ………………………………………………………. 32 15<br />
6.7.1. Tryptischer <strong>in</strong>-Gel-Verdau von Prote<strong>in</strong>en …………………………………. 32 15<br />
6.7.2. Erstellung von Peptidmassen-F<strong>in</strong>gerpr<strong>in</strong>ts ……………………………….. 33 15<br />
6.8. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ………………………………. 33 16<br />
6.8.1. Bestimmung von Am<strong>in</strong>osäuren ……………………………………………….. 33 17<br />
6.8.2. Bestimmung von organischen Säuren ……………………………………… 34 17
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