Untersuchungen zum Überflussmetabolismus in Escherichia coli

44 Ergebnisse
1.1.3. Nachweis der Überexpression durch Enzymaktivitätsbestimmung
Um die Überexpression der Gene sucAB, sucCD und sdhCDAB in dem Stamm
MG1655∆Psdh::Ptet auf Proteinebene nachzuweisen, wurden die Enzymaktivitäten von α-
Ketoglutaratdehydrogenase, Succinyl-CoA-Synthetase und Succinatdehydrogenase bestimmt.
Dazu wurden die Stämme MG1655 WT und MG1655∆Psdh::Ptet in Minimalmedium + 10 mM
Glucose kultiviert, während der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und die
Rohextrakte zur Bestimmung der Enzymaktivitäten verwendet. Zusätzlich wurde auch die
Aktivität der Citratsynthase bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Die Werte stammen aus zwei unabhängigen Kultivierungen jeweils beider Stämme.
Tab. 4: Spezifische Aktivitäten von TCA-Zyklus-Enzymen in Rohextrakten von E. coli
MG1655 und MG1655∆Psdh::Ptet aus der exponentiellen Phase bei aerober Batch-Kultivierung
(Fermenter) in Minimalmedium + 10 mM Glucose im Fermenter
Spezifische Aktivität [nmol min -1 (mg Protein) -1 ]
Stamm
α-Ketoglutarat-
Dehydrogenase
Succinyl-CoA-
Synthetase
Succinat-
Dehydrogenase
Citratsynthase
MG1655 WT 31 +/- 1 350 +/- 17 90 +/- 25 90 +/- 21
MG1655∆Psdh::Ptet 53 +/- 2 1460 +/- 35 380 +/- 7 270 +/- 14
In den Rohextrakten des Stammes MG1655∆Psdh::Ptet konnten gegenüber dem Wildtyp
deutlich erhöhte spezifische Aktivitäten der α-Ketoglutaratdehydrogenase, der Succinyl-CoA-
Synthetase und der Succinatdehydrogenase nachgewiesen werden. Die spezifischen
Aktivitäten von Succinyl-CoA-Synthetase und Succinatdehydrogenase waren um den Faktor 4
erhöht. Diese Werte liegen in der gleichen Größenordnung, wie beim Vergleich der
Expression auf Transkriptebene (s. Abschnitt 1.1.2.). Die α-Ketoglutaratdehydrogenase
zeigte 1,7-fach erhöhte Aktivität gegenüber dem Wildtyp (s. Tab. 4 und Abb. 8).
In den Rohextrakten des Stammes MG1655∆Psdh::Ptet konnte außerdem eine gegenüber
dem Wildtyp um den Faktor 3 erhöhte spezifische Aktivität der Citratsynthase nachgewiesen
werden.