Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen

Methoden
4.2 Immunhistochemische Färbungen
4.2.1 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen
3-7 Tage alte Fliegen wurden in Eis-gekühltem Ringer präpariert und anschließend für 2h
auf Eis in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Gehirne wurden bei Raumtemperatur 3x20min
mit 0,5% Triton (PBST) gewaschen. Daraufhin wurden die Gehirne für 2h in eine
Blocklösung (PBST + 2% BSA) gegeben. Danach wurden die primären Antikörper
appliziert (siehe Seite: 35) und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die
primären Antikörper entfernt und die Gehirne wurden für 3 x 20min mit PBST gewaschen.
Danach wurden die Gehirne einmal mit PBS + 3% NGS (Normal Goat Serum) für 30min
gewaschen und anschließend die sekundären Antikörper hinzugegeben (Konzentration
siehe Seite: 36). Daraufhin wurden die Gehirne bei 4°C über Nacht inkubiert. Am dritten
Tag wurden die sekundären Antikörper abgenommen und die Gehirne mit PBST 3 x 30min
gewaschen und über Nacht in PBS gelassen. Am folgenden Tag wurden die Gehirne in
Vectaschield eingebettet.
4.2.2 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Mit Hilfe der Konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (Leica TC SP2, Leica
Microsystems GmbH) wurden die Daten erhoben. Für die Aufnahmen wurde das Leica
Apochromat 20x 0,7NA Wasser-Immersions-Objektiv genutzt. Es wurde mit einer
Pinhole-Öffnung von 1,0 und mit einem Abstand in den Fokalen Ebenen von 1,5µm
gearbeitet. Die verwendeten Wellenlängen für die Fluoreszenzanregung waren 488nm für
Alexa488, 633nm für Alexa633 und 550nm für Cy3. Nach der Durchführung der Konfokal
Mikrokopie wurden die Bildverarbeitungsprogramm ImageJ (National Institutes of Health,
USA) ausgewertet und mit Photoshop (Adobe Systems, Inc., USA) als Bild visualisiert.
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