Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen

Methoden
Durchführung einer qPCR enthielt. Neben 10µl SsoFast wurden jeweils 0,6µl pro Primer
und 0,4µl je Probe zusammengemixt. Daraufhin wurde die cDNA in einer Konzentration
von 50ng/µl hinzugegeben. Das Reaktionsvolumen wurde auf ein Gesamtvolumen von
20µl mit RNA-freiem Wasser aufgefüllt. Dies gilt als ein biologisches Replikat. In jeder
qPCR-Reaktion wurden jedoch pro biologisches Replikat, drei technische Replikate
durchgeführt.
Die qPCR wurde mit einem Thermocycler (Bio-Rad CFX96) mit dem Programm:
„CFX_2StepAMP.qpcr“ durchgeführt. Das Programm enthält folgende Schritte:
1 95°C für 1min
2 95°C für 10s
3 55°C für 30s
} 39x
Anschließend wurden die erhobenen Daten mit dem Programm CFX visualisiert. Die
folgende Auswertung wurde mit dem Statistik-Programm Origin8.5 durchgeführt. Es
wurden die cq-Werte für das ribosomales Protein Rp49 und die cq-Werte für SIFamid der
einzelnen Gruppen entnommen. Je Gruppe wurden die cq-Werte für SIFamid durch die cq-
Werte für Rp49 dividiert. Aus dem cq-Werten für CS wurde das arithmetische Mittel
gebildet. Das arithmetische Mittel von CS wurde daraufhin durch die ermittelten Werte der
einzelnen Gruppen dividiert. Dadurch wurden die Gruppen auf CS normalisiert. Somit
konnte eine mögliche Reduktion des Neuropeptides SIFamid festgestellt werden. Für die
graphische Darstellung wurden die Mittelwerte ± Standardfehler der Gruppen aufgetragen.
Es wurde mit Origin8,5 mit den erhobenen Daten eine ANOVA durchgeführt und
anschließend als post-hoc Entscheidung eine Bonferroni-Korrektur durchgeführt.
4.5 Molekulare Klonierungen
Für die Generierung von neuen transgenen Fliegen (SIFa-LexA und LexAOp:dTrpA1-
mCherry) wurden verschiedene Vektoren benutzt. Es wurde ein LexA Konstrukt unter der
Kontrolle des SIFpromotors (Terhzaz et al., 2007) und ein dTrpA1-mCherry Konstrukt
(Atefeh Pooryasin, nicht veröffentlicht) unter Kontrolle von LexAOp generiert. Die DNA
wurde mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und wurde dann in
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