Öffnen - eDiss - Georg-August-Universität Göttingen

Methoden
Nach dem Homogenisieren wurden die Proben bei 4°C für 3min mit 6000rpm in einer
Kühlzentrifuge zentrifugiert. Danach wurde die Flüssigkeit abgenommen, in ein 1,5ml
Eppendorfgefäß überführt und für 5min bei RT inkubiert. Daraufhin wurde zu den Proben
100µl Chloroform gegeben, gevortext sowie für 5min bei RT inkubiert. Die Proben
wurden dann für 15min mit 14800rpm bei 4°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation
wurde der Überstand abgenommen und in ein neues 1,5ml Gefäß gegeben. Hinzu kam die
gleiche Menge an Isopropanol. Die Proben wurden erneut gevortext und 1h bei 4°C
aufbewahrt. Daraufhin wurden die Proben für 30min mit 14800rpm bei 4°C zentrifugiert,
so dass sich ein Pellet bildete. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Das
gewonnene Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen und bei 4°C für 10min mit
10000rpm zentrifugiert.
Anschließend wurden die Proben mit DNase aus den „RNase-Free DNase Set“ für die
RNA Reinigung weiter behandelt, die Reagenzien wurden wie folgt:
87,5µl RNA-freies Wasser
10µl Buffer RDD
2,5µl DNase I
hinzugegeben und für 10min bei RT inkubiert.
Danach wurde nach dem Protokoll von dem RNeasy Kit (Qiagen) die weitere Behandlung
durchgeführt. Anschließend wurde die RNA-Konzentration gemessen und cDNA aus der
RNA hergestellt. Die cDNA wurde mit dem iScript „cDNA Synthesis Kit“ (Bio-Rad) wie
folgt hergestellt:
4µl 5x iScript Reaction Mix
1µl Reverse Transkriptase
RNA = 1000ng
Auffüllen mit RNA-freiem Wasser: Gesamtvolumen 20µl.
Die Proben wurden für 5min bei 25°C inkubiert, unmittelbar danach für 30min bei 42°C,
und um die Reaktion zu stoppen für 5min auf 85°C inkubiert.
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