Enzkin - Elm-Asse-Kultur

formatiert für HP4 Laserjet 2200 PCL6
Vorgesehenes Seminarpensum:
Tag Kapitel
"ENZYMKINETIK UND ...
- MECHANISMUS"
Texte und Versuchsvorschriften
zum Praktikumsblock BB3
05.12.-16.12.2005
Tag
Kapitel
Mo 1.1,2.1,2.3,2.4,4.10
Versuche A1 bis A6
Di 3.5,8.10,8.13
Versuche A (Rest), Versuch E.2.1
Mi 5
Versuche B
Mo 8.1 - 8.7
Versuch E.2.2
Di 8.8
Versuche E1-E4 (Rest)
Mi 9
Versuche F und Abschlussbesprechung
Do 1,6
Versuche C
Fr 2.2,3.2, 7
Versuche D
Do
Fr
Heimarbeit (Protokolle)
einige schriftliche Wiederholungsfragen
(Klausur)
Jürgen Bode http://enzkin.de.vu
Astrid Hans
Julia Garbe
Svenja Lüders

Inhalt
Enzymkinetik heute
Die Enzymkinetik ist ein in allgemeingültigen Gesetzmäßigkeiten,
Begriffen und Theorie abgeschlossener Teil der Biochemie;
Fortschritte sind daher in diesem klassischen Haus nicht zu erwarten, nur
Ausbauten. So haben die Methoden der Auswertung und Datenverarbeitung
durch elektronische Schnellrechner Routine gewonnen. Statistik ist keine
Mühsal mehr sondern nur einen Knopfdruck weit entfernt...
...die zitierte Literatur geht in Einzelfällen bis in die neuere Zeit, aber man sieht
doch, dass die Enzymkinetik ihren Höhepunkt in der vorigen Generation hatte -
jetzt bewährt sie sich in der Praxis und hat dadurch
eine hoffnungsvolle Renaissance.
Lothar Jänicke (1994) zu “Enzymkinetik - Theorie und Methoden” von Hans Bisswanger; VCH 1994;
N 3-527-30032-5 - gleichzeitig eine Literaturempfehlung.
Ein Biologe ohne enzymkinetische Grundkenntnisse
ist wie ein Haus ohne Fundament...
Leopold Flohé (2000)

INHALTSVERZEICHNIS
1. ALLGEMEINE ARBEITSHINWEISE UND INFORMATIONEN
1.1 Einige Abkürzungen und Definitionen 8
1.2 Methoden zur Bestimmung des Proteingehaltes 10
1.2.1 UV-Methode am Beispiel der GAPDH
1.2.2 Biuret-Methode 10
1.2.3 Methode nach Lowry 11
1.2.3.1 Bicinchoninsäure (BCA-) Variante 12
1.2.4 Fluram- (Fluorescamin-) Methode 13
1.2.5 Bradford-Test 14
1.2.6 Zur Präzision wichtiger Proteinbestimmungs-Verfahren 16
2. METABOLISCHE UND ENZYMOLOGISCHE GRUNDLAGEN
2.1 Schwerpunkt dieses Praktikums: Glycolyse-Enzyme 17
2.2 Stellung der Glycolyse im Energiestoffwechsel 18
2.3 Coenzyme der Dehydrogenasen (GAPDH; GDH; LDH):
NAD + und NADH,H + 19
2.4 Prinzip des Aktivitätstests für NAD + abhängige 20
Dehydrogenasen: der optische Test
3. CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE DATEN
3.1 für NAD + und NADH (molare Extinktionskoeffizienten) 21
3.2 für Phosphofructokinase (PFK) 21
3.4 für GAPDH 23
3.5 für Pyruvatkinase 24
3.5 für LDH 25
4 AKTIVITÄTSTESTS :GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN
4.1 Einleitung zu den Versuchen Versuche A 26
4.2 Präparation des Muskelextraktes (A0) 28
4.3 Aktivitätstests für Lactat-Dehydrogenase 28
4.3.1 "Vorwärtsreaktion" (A1.1)
4.3.2 "Rückwärtsreaktion" (A1.2) 29
4.4 Kombinierter Test für PGK und GAPDH
(Rückwärtstest) (A2) 30
4.5 Kombinierter Test für Aldolase und GAPDH (A3) 31
4.6 Aktivitätstest für Aldolase (Hydrazonbildung) (A4) 31
4.7 Kombinierter Test für Aldolase und Triosephosphat-
Isomerase (A5) 32
4.8 Aktivitätstest für Triosephosphat-Isomerase (A6) 32
4.9 Die "Vorwärtsreaktion" der GAPDH
4.9.1 Darstellung des GAPDH-Substrates (GAP) (A7.1) 33
4.9.2 Standardisierung der GAP-Lösung (A7.2) 33
4.9.3 Aktivitätstest für GAPDH (A7.3) 34
4.10 Rechenbeispiel zu Aktivitätsbestimmungen:
Volumenaktivität und spezifische Aktivität 35
5. ZUR FREIEN STANDARDENTHALPIE (∆G o ) UND FREIEN ENTHALPIE (∆G)
CHEMISCHER REAKTIONEN
5.1 Einleitung zu den Versuchen Versuche B 37
5.2 Freie Standardenthalpien der Glycolysereaktionen 38

4
Inhalt.
5.3 Freie Standardenthalpie der GAPDH- und GDH-Reaktionen 38
5.3.0 Berechnung von Gleichgewichtskonstanten aus
Literaturwerten für ∆G o (B0) 38
5.3.1 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der
GAPDH-Reaktion (Gleichgewichtseinstellung) (B1) 39
5.3.2 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der
GAPDH-Reaktion (kinetischer Ansatz) (B2) 40
5.3.3 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der
GDH-Reaktion (B3) 41
6. BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN
BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
• NACH DER ENDPUNKTMETHODE: Versuche C 43
6.1 Das Messprinzip
6.2 Versuche am Kaninchenmuskel-Extrakt (C1) 43
6.2.1 Nachweis von ATP (C1.1) 43
6.2.2 Nachweis von 3-PG (C1.2) 44
6.2.3 Nachweis von DAP und benachbarten Metaboliten (C1.3) 44
6.2.4 Lage des NAD + /NADH,H + -Gleichgewichts im Muskel (C1.4) 44
6.3 Versuche an diversen proteinfreien Extrakten (C2) 46
6.3.1 Herstellung eines Extraktes aus Kaninchenherz (C2.2)
6.3.2 Entproteinieren des Skelettmuskelextraktes
durch Pepsin (C2.2) 46
6.3.3 Metabolitengemisch unbekannter Herkunft (C2.3)
6.3.4 Energiereiche Phosphate: ATP (C2.4.1) 47
6.3.5 ” “ Creatin-Phosphat (CP) (C2.4.2) 48
6..6 Energiemangel-Metabolite: ADP (C2.4.3) 49
" “ AMP (C2.4.4) 49
6.3.8 " “ Creatin (C2.4.5) 49
• NACH DER KINETISCHEN METHODE:
6.4.1 Das Messprinzip 50
6.4.2 Prinzip der Biolumineszenz 50
6.5 Biolumineszenzmessungen mit dem Luminometer 51
6.5.1 Luciferin/Luciferaserpräparat (C3.0) 51
6.5.2 Eichreihe für ATP (C3.1) 51
6.5.3 Energiereiche Phosphate: ATP und Creatin-P (CP) (C3.2) 52
7. REGULATORISCHE ENZYME
7.1 Phosphofructokinase: ein Schlüsselenzym bei der Versuche D 54
Regulation des Metabolitenflusses im Glycolyseweg 54
7.2 Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus von
Effektoren bei oligomeren Enzymen: Beispiel der
Phosphofructokinase der Glycolyse 55
7.3 Zur Regulation der Phosphofructokinase (D1) 56
7.4 Phosphofructokinase, ein kooperatives Enzym (??) (D2) 59
7.5 Pyruvatkinase, ein kooperatives Enzym (?) (D3) 59
8. BESTIMMUNG VON K M UND K I WERTEN
8.1 Sättigungsphänomene: der ES-Komplex Versuche E 62
8.2 Katalytische Effizienz: das k cat /K m -Kriterium 63
8.2.1 Abschätzung der katalytischen Effizienz 64

5
Inhalt.
8.3 Ableitung der Michaelis-Menten Beziehung 66
8.4 Nichtlineare Regression: Angleichung der Michaelis-
Menten-Beziehung 67
8.5 Linearisierung der Michaelis-Menten Beziehung 68
8.5.1 Lineweaver-Burk Auftragung 67
8.5.2 Eadie-Hofstee und Scatchard Auftragungen 68
8.6 Parametervergleich: Bindungsmessungen und Enzymkinetik 69
8.7 Zur Auswertung enzymkinetischer Daten:
Merkmale verschiedener Plots 69
8.7.1 Computergestützte Analyse 69
8.7.2 Bedeutung konventioneller Auftragungen 69
8.7.3 Allosterie und Kooperativität 72
8.7.3.1 Definition und Darstellung kooperativer Bindungsphänomene 73
8.8 Soforttest für Messwerte: die direkt-lineare Auftragung 75
8.9 Enzymhemmungen 76
8.9.1 Die kompetitive Hemmung 77
8.9.2 Die allosterische Hemmung 78
8.9.3 Die "nicht-kompetitive" (allgemeiner: "mixed-type") Hemmung 79
8.9.4 Die "unkompetitive" Hemmung 80
8.9.5 Nomenklaturvorschläge und Definitionen zum Gebiet
der Enzymhemmung und -regulation 82
8.9.6 Bestimmung von K i und K is aus sekundären Plots 82
8.9.7 Dixon-Auftragung zur direkten Ablesung von K i -Werten 85
8.10 Der K m -Wert der LDH-Pyruvat Reaktion; Inhibition
durch NAD + , Salicylat oder Oxamat (E1) 86
8.11 Isoenzyme der Lactat-dehydrogenase (E2) 89
8.11.1 "Hydroxybutyrat-Dehyrogenase"-Aktivität der LDH-
Isoenzyme in Herz und Leber (E2.1) 90
8.11.2 K m -Werte der LDH-Isoenzyme (E2.2) 91
8.12 Der K m -Wert der Alkoholdehydrogenase-Ethanol Reaktion (E3) 93
Berechnung von Inhibitionskonstanten
aus optimierten Datenreihen (E4) 94
8.14 BESONDERHEITEN VON MEHRSUBSTRAT-REAKTIONEN 94
8.14.1 Sequenzieller Mechanismus: geordnet oder willkürlich 95
8.14.2 Ping-pong bi-bi Mechanismus 98
9 TRICKS UND 'trouble-shooting'
9.1 Funktioniert das Photometer? 98
9.2 Optimierung der Versuchsbedingungen bei schlecht
auswertbaren Kinetiken 98
9.2 Prinzip der nichtlinearen Regressionsanalyse
9.2.1 Anfangsgeschwindigkeiten aus der integrierten Michaelis-
Menten Gleichung 99
9.2.2 Anwendung eines Polynoms zur Ermittlung der
Anfangsgeschwindigkeit aus Zeit-Umsatzkurven 99
10. ZUR BEDEUTUNG VON CYSTEINEN FÜR ENZYMATISCHE AKTIVITÄTEN
(REAKTIONSKINETIK) Versuche F 101
10.1 Zur Auswertung von Kinetiken für Reaktionen zweiter Ordnung 102
10.1.1 Reaktion zweiter Ordnung unter ṕseudo-first ordeŕ Bedingungen
10.2 Titration aller Cystein-Reste an GAPDH (F1) 103
10.3 Untersuchung von Cystein-Reaktivitäten in nativer GAPDH (F2) 103

6
Inhalt.
11. APPENDICES 105
• Seminarthemen 106
• Anleitung zum Gebrauch der Enzkin Programme 107-113
• Enzymkinetik und -Mechanismus in Wikipedia 114
• Geometrische Eigenschaften einer Hyperbel 115
• Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung 116
• Lösungsweg zur Aufgabe B0 117
• Halblogarithmisches Papier (beim Assistenten)
STICHWORTVERZEICHNIS (Index) 118
ÜBERSICHT: GRAPHISCHE AUSWERTUNGSVERFAHREN (PLOTS) vergl. Kap.8.7
Dixon (K i )
Eadie-Hofstee (K m , K i , V max )
Eisenthal-Cornish-Bowden (K m , V max )
Hanes (K m , K i , V max )
Hill (Kooperativitätsparameter, K m (K 1 , K 2 bzw. n H )
Lineweaver-Burk (K m , Ki , V max)
Halblogarithmische Auftragung (Reaktionskinetik)
******

7
Inhalt.
ÜBERSICHT: ZU BB3 ENTWICKELTES PROGRAMMPAKET
(Hauptkomponenten im Großdruck)
Activity - berechnet Dehydrogenase Aktivitäten
Bestline - lineare Regression
Composit - simuliert zusammengesetzte Hyperbeln u.v.m.
Emod - Kinetik von Enzymgiften
G0 - Berechnung freier chemischer Reaktionsenthalpien
KmVm - nichtlineare Regression: Hyperbel (Vorstufe von MMenten)
Makafil - universelle Dateneingabe; Datenkonversion
zwischen Standard- und Enzfitter-Format
MMenten - graphische Darstellung (primär) für Michaelis-Menten Enzyme
Mr - relative Molekülmasse durch verschiedene Anpassungen
V0 - enzymatische Anfangsgeschwindigkeit
Viewafil - Dateninspektion und graphische Ausgabe
***
EMPFOHLENE KOMMERZIELLE PROGRAMME
Enzpack - Demonstrationsprogramm für Plots, Fehlerverteilung, Inhibitionsphänomene; dieses Programm
erhielt während der Praktika 1987/88 die Fähigkeit zur nichtlinearen Regression; die aktuelle Version (1998)
bietet inzwischen exakt diese Möglichkeiten (Elsevier Biosoft; 199 Euro).
Enzfitter - Nichtlineare Regressionsanalyse beliebiger Funktionen. Ein komfortabler Editor für
Gleichungssysteme ist enthalten. (Elsevier Biosoft; 399 Euro; Demonstrationsversionen beider Programme
unter http://www.biosoft.com). Weiterentwicklung: Grafit; Elsevier Programme werden auch von Sigma
Chemicals vertrieben.
DNRPeasy - Nichtlineare Regressionsanalyse nach Ronald Duggleby, gemeinsame mathematische Basis
mit Composit; viele eingebaute Gleichungen aus dem Bereich der Enzymkinetik; Einbau eigener
Gleichungen ist nur sehr bedingt möglich. Möglichkeit zur Erstellung von Druckerfiles. Zu beziehen von: Dr.
R. G. Duggleby, Department of Biochemistry, University of Queensland, QLD 4072, AUSTRALIA, ca. 50$
Enzfitter korrespondiert mit unserem "Composit" (via Makafil); es besitzt exzellente Graphikfähigkeiten,
insbesondere nach Daten-Aufarbeitung im separaten Programm "Enzplot". Im Unterschied zu Composit und
DNRPeasy erlaubt es nur die Eingabe von Zahlenreihen mit einer unabhängigen Variablen und es erfordert
zumeist die Eingabe von Schätzwerten für die abhängigen Variablen.

Arbeitshinweis
1. ALLGEMEINE ARBEITSHINWEISE
1.1 Einige Abkürzungen und Definitionen
A
(engl. "absorption") steht hier nach internationalen Gepflogenheiten für das
deutsche "E" (Extinktion) und wird auch gleichbedeutend mit "OD" (optische
Dichte) gebraucht. A 340 / E 340 / OD 340 wäre die Absorption/ Extinktion/ optische
Dichte bei einer Wellenlänge von 340 nm. A ist ein Maß der Reagenzkonzentration
in Lösung, Proportionalitätsfaktor ist der molare
Extinktionskoeffizient, ε. "d" ist die Schichtdicke der Küvette, hier durchweg
gleich 1 [cm].
A≡ E = ε ⋅c⋅d
Achtung: in deutschen Lehrbüchern der Physikochemie wird die Absorption gelegentlich als
Kehrwert der Transmission (1/T) definiert, hier als log(1/T).
BPG
c
1,3-Bisphosphoglycerinsäure
Molare Konzentration (Molarität einer Lösung. Einheit: mol/l (früher: M). Für
NAD + wäre eine Lösung mit 1 mol/l eine solche mit 663.4 g/l (663.4 mg/ml).
DAP Dihydroxyaceton-phosphat.
DPG 1,3- Diphosphoglycerinsäure jetzt 1,3-Bisphosphoglycerinsäure
ε In dieser Schreibweise handelt es sich um den molaren
Extinktionskoeffizienten, die hypothetische Extinktion (Absorption, optische
Dichte) einer Lösung mit 1 mol/l. Eine sinnvolle Angabe schließt die Wellenlänge
in nm mit ein, z.B. "ε 340 ".
Achtung: Angaben wie ε 280 1% sind durchaus üblich und kennzeichnen die Extinktion einer
1%igen Lösung (d.h. einer solchen mit 10 mg/ml) bei 280 nm.
E
Extinktion; siehe A (Absorption)
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure; wichtiger Chelator für Ca ++ /Mg ++ und üblicher
Pufferzusatz; Handelsbezeichnung: Titriplex III (Merck).
" enzyme unit"
Gängige Einheit enzymatischer Aktivitäten. 1 unit: 1 µmol Substratumsatz je
min. Eine weitere gängige Aktivitätseinheit ist das katal (abgekürzt kat). 1 unit
= 16,67 nkat.
Achtung: Viele andere, individuell definierte units sind im Umlauf. Beispiel: 1 unit einer
Restriktionsendonuclease setzt für den Genetiker 1 µg lambda-DNA in der Stunde um!
PFK Phosphofructokinase, auch Fructose-6-phosphat-kinase. Es gibt neuerdings
zwei Varianten, die keine Isoenzyme sind: PFK1 und PFK2.
F-1,6 DP/F-1.6BP
Fructose-1,6-dihosphat (jetzt: Fructose-1,6-bis-phosphat)
GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat.
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase.

Arbeitshinweis
GDH Glycerinphosphat-dehydrogenase.
M
M
M r
Heute: Molekülmasse; Beispiel NAD + : 663.4 g (Gramm).
Früher: Molarität. Eine 1 M Lösung enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml.
Relative Molekülmasse; Beispiel NAD + : 663.4 (dimensionslos! Vielfaches von
1 / 12 C).
m
NAD +
Molekulare Masse; Beispiel NAD + : 663.4 Da (Dalton).
ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (ganz früher: DPN).
NADH,H + Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduzierte Form.
NBS - 5-Thio-2-nitrobenzoesäure (Thiolat-Anion)
(NBS) 2 Früher: DTNB; 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)(3,3'-6)
PGK 3-Phosphoglyceratkinase.
3-PG 3-Phosphoglycerat.
P i
T
TEA
TIM
Anorganisches Phosphat.
Transmission;
primärer Messparameter von Photometern, abgeleitete Größen siehe unter "A". Der moderne
Biologe wird dem "T" kaum noch begegnen und verläßt sich darauf, dass sein Photometer
einen T-E-Wandler enthält. Bei Praktikumsgeräten ist dies allerdings nicht so selbstverständlich.
Triethanolamin;
freie Base oder Hydrochlorid. Gängige Puffersubstanz im pH-Intervall 7-9. TEA x HCl (pH 8)
wäre eine TEA-Lösung, welche mit HCl auf pH 8 gestellt ist.
Triosephosphat-isomerase (überführt GAP in DAP und umgekehrt).
Tris-Acetat Tris-Lösung, die mit Hilfe von Essigsäure auf den angegebenen pH- Wert
gebracht worden ist.

Arbeitshinweis
1.2 Methoden zur Bestimmung des Proteingehaltes
1.2.1 UV-Methode am Beispiel der GAPDH
Der molare Extinktionskoeffizient für den typischen GAPDH/NAD + -Komplex bei 276
nm ist 146000, die relative Molmasse (M r ) 144000; eine Lösung von 1 mg/ml
GAPDHx3NAD + wiese also eine E 276 von 146/144 = 1.01 auf. Die
Proteinkonzentration ergibt sich allgemein durch Messung der E 276 und Multiplikation
mit 0.99:
E
⋅ . = mg / ml
276
099
GAPDHx3NAD + ist die Form, in der das Enzym aus Kaninchenmuskel normalerweise
isoliert wird. Um den variablen Gehalt an Coenzymen zu berücksichtigen, wird die
Verwendung der Beziehung
empfohlen.
(. 155⋅E ) −( 076 . ⋅ E ) = mg
/ ml
280 260
1.2.2 Biuret-Methode (zur Zeit nicht durchgeführt)
Prinzip: das Kupfer-Ion wird zum Zentralatom eines violetten Farbkomplexes, der sich in Gegenwart von Peptidbindungen bzw.
zwei Säureamidbindungen bildet. Ob Kupfer im Komplex zweiwertig bleibt oder teilweise zu Cu + reduziert wird ist unklar ( vergl.
Anal.
Biochem. 150, 76, 1985)
Abb. 1.1 Biuret-Reaktion; Struktur des Biuret-Cu ++ -Komplexes
a, Die Abhängigkeit der Biuret-Reaktion von der -CO-NH- (d.h. Peptid-) Gruppierung
b, dto., gebildet mit der -CO-NH 2 (d.h. Biuret-) Gruppe
c, Aminosäuren binden Cu ++ chelatartig, jedoch ohne Bildung von Farbkomplexen.
Die Biuret-Methode ist weitgehend störungsfrei, da im kritischen Wellenlängenbereich nur Gallenfarbstoffe eine
schwache Extinktion aufweisen. Proteine sind die einzigen Substanzen in biologischen Materialien, die eine Biuret-Reaktion
ergeben. Allerdings versagt die beschriebene Variante in Gegenwart von Ammoniumsalzen.
Die Farbentwicklung der Biuret-Komplexe ist bei verschiedenen Proteinen weitgehend konstant (d.h. proportional der
Kettenlänge). In dieser Hinsicht ist die Methode den anderen hier beschriebenen Verfahren überlegen. Allerdings benötigt sie
wesentlich mehr Material.
Materialien:
CuSO 4 . 5H 2 O
Na-K-Tartrat (NaKC 4 H 4 O 6 . 4H 2 O)
75% NaOH-Lösung (Carbonat-frei, in Plastikflasche)
0.1% KJ (bei Bedarf)
BSA (bovine serum albumin) als Eichprotein
Daten:BSA, ε 280 1% : 6.6(Wert einer Lösung mit 10 mg/ml)
Biuret-Reagens:
150 mg CuSO 4 . 5H 2 O und 600 mg Na-K-Tartrat in je 10 ml H 2 O lösen. Lösungen vereinigen und auf 50 ml auffüllen . Auf dem
Magnetrührer 30 ml 10%iger NaOH-Lösung (aus obiger Stammlösung) zusetzen und mit H 2 O auf 100 ml auffüllen. In einer
Plastikflasche ist dieses Reagens langfristig haltbar. Die Einstellung auf 0.1% KJ wirkt stabilisierend d.h. verhindert die

11
Arbeitshinweis
Reduktion des Reagens. Die Lösung muss beim Auftreten roter oder schwarzer Präzipitate verworfen werden.
Eichreihe (allgemeine Vorschrift):
140 mg BSA oder Eiweiß-Lysozym einwiegen und in 5 ml H 2 O (bzw. Probenpuffer)
lösen. Auffüllen auf 10 ml. Extinktion einer 1:10 Verdünnung messen.
Sollwerte für 1 mg/ml
BSA: E 280 = 0.66
Lysozym: E 281,5 = 2.64
V o ml der Stammlösung durch Verdünnen (d.h. Zugabe von
BSA:
Lysozym:
∆v = V o (E 280 /0.66) - V o bzw.
∆v = V o (E 281,5 /2,64) - V o
ml) auf 10 mg/ml einstellen. Verdünnungsreihe ansetzen:
1)100 µl Stammlösung + 900 µl Puffer : 1mg/ml (Sollwert)
2) 200 µl " + 800 µl " : 2mg/ml
...
...
...
9) 900 µl " + 100 µl " : 9mg/ml
10)Stammlösung:
10mg/ml
Durchführung:
In Plastik-Küvetten werden 400 µl Proben (mit 1-10 mg BSA/ml) mit 1.6 ml Biuret Reagens versetzt. Die Proben stehen nach
guter Durchmischung für 30 min bei Raumtemperatur. Analog verfährt man mit 400 µl einer adäquaten Verdünnung des
Muskelextraktes. Eine Blindprobe enthält 400 µl H 2 O (bzw. Probenpuffer) und 1.6 ml Biuret Reagens.
Man misst die Extinktion aller Proben bei 550 nm und konstruiert eine Eichkurve, aus der dann die Konzentration der
unbekannten Proben abgeleitet wird.
Für die Auswertung sollten nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden. Nur in diesem Fall ist eine
Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline");
"Bestline" führt eine Standard-lineare- Regressionsanalyse durch; der zwangsläufige Ursprung [0,0] wird nicht
berücksichtigt. Soll die Regressionsgerade durch den Nullpunkt verlaufen, so kann das Polynom nach Kap. 9.2.2, d.h.
eine Funktion des Programms "Composit" eingesetzt werden. Eine Ursprungsgerade folgt, wenn a o , a 2 und a 3 gleich
1E-27 gesetzt und maskiert werden. Betreuer fragen!).
1.2.3 Methode nach Lowry (Zur Zeit nicht durchgeführt)
J. Biol. Chem. 193, 265 (1951); Meth. Enzymol. III, 448
Die nach Lowry modifizierte Folin-Methode hat gegenüber einer Extinktionsmessung bei 280 nm den Vorteil einer 10-
20fach höheren Empfindlichkeit; sie ist 100x so empfindlich wie die Biuret-Methode. Aber: Das Verfahren kann in Abhängigkeit
vom Protein zu unterschiedlichen Farbwerten führen, und die erzielte Farbe ist nicht immer direkt proportional der Proteinkonzentration.
Die Farbentwicklung beruht auf
- der Biuret-Reaktion von Peptiden mit Cu ++ im alkalischen Milieu
- der Reduktion von Phosphomolybdän/Phosphowolframsäure durch Tyrosin- und Tryptophanreste des Proteins.
Reagenzien:
Folin-Ciocalteau-Reagens (kommerziell erhältlich).
(Der Herstellungsgang für sparsame Naturen:
Eine Mischung aus 100 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 25 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 50 ml 85 % H 3 PO 4 , 100 ml konz. Salzsäure und 700 ml H 2 O
werden für 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Die Mischung wird mit 150 g Li 2 SO 4 , 50 ml H 2 O und einigen Tropfen wässriger Br 2 -
Lösung versetzt, für 15 min nochmals ohne Kühler zum Sieden erhitzt und gekühlt. Nach Auffüllen auf 1 Liter wird filtriert. Falls
das Produkt eine grünliche Farbe hat, ist es unbrauchbar, die Prozedur ist zu wiederholen!!).
1) 2 % Na 2 CO 3 in 0.1 M NaOH

12
Arbeitshinweis
2) 0.5 % CuSO 4 5H 2 O in 1 % K-Tartrat
Ansetzen als separate Lösungen mit 1 % Cu-Sulfat bzw. 2% K-Tartrat, dann im Verhältnis 1:1 mischen
3) Gebrauchslösung: 50 ml (1) + 1 ml (2);
vor Gebrauch ansetzen. Empfindlichkeitsverlust bei Raumtemperatur ca 40% je Woche.
4) eine 1:3 Verdünnung des Folin-Ciocalteau-Reagenz
Durchführung
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA (analog Kapitel 1.2.2). Hierfür werden die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 200fach
verdünnt (Endkonzentrationen 5-50 µg/ml). 0.3 ml dieser Verdünnungen werden in Plastik-Küvetten mit 1,5 ml
Gebrauchslösung (3) versetzt, gemischt und für 15 min belassen. Unter Schütteln werden dann 200 µl Folin-Reagenz (4)
zupipettiert. Nach mindestens 30 min wird die Extinktion bei 750 nm abgelesen. Der Muskelextrakt wird wie die Eichlösungen
verdünnt und mit deren Extinktionswert verglichen.
Für die Auswertung sollten nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden. Nur in diesem Fall ist eine
Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline"; verg. Kap.
1.2.2). Für sehr konzentrierte Proben kann man vom Extinktionsmaximum abweichen und Messungen, z.B. bei 500 nm,
durchführen. Es ist strikt darauf zu achten, dass die auszuwertenden Proteinlösungen frei sind von Reduktionsmitteln (2-
Mercaptoethanol, Dithiothreitol o.ä.; siehe Prinzip der Farbentwicklung). Einige nichtionische Detergentien sowie gängige
Puffersubstanzen können durch Präzipitatbildung mit dem Folin-Reagens stören.
1.2.3.1 Bicinchoninsäure-(BCA-)Variante
Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985)
Das Folin-Reagens hat den Nachteil hoher Instabilität
im alkalischen Milieu und gelegentlicher unerwarteter
Präzipitatbildung. Smith et al. nutzten die Tatsache,
dass reduzierende Proteinreste stöchiometrische
Mengen des Cu ++ zu Cu + reduzieren, die Biuretreaktion
mit einer Cu + -abhängigen Farbreaktion zu koppeln
Reagens A
Reagens B
1 g BCA 4 g CuSO 4 x5H 2 O Abb. 1.2 Prinzip der BCA-Reaktion
2 g Na 2 CO 3 xH 2 O in 100 ml H 2 O
160 mg Na-Tartrat
400 mg NaOH
950 mg NaHCO 3
- auffüllen auf 90 ml - ggf. pH-Wert (Soll: 11.25) korrigieren mit NaOH
- auffüllen auf 100 ml
Arbeitslösung (mindestens eine Woche stabil): 10 ml Reagens A plus 200µl Reagens B
Durchführung
A - Küvettenverfahren
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA (analog Kapitel 1.2.2). Hierfür werden
die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 300fach verdünnt (Endkonzentrationen 3.3-33
µg/ml). In Plastik-Küvetten werden 0.1 ml dieser Proben mit 2 ml Arbeitslösung
gemischt und entweder für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder für 30 min bei 37 o
inkubiert; nach diesen Zeiten beträgt der Extinktionsanstieg noch etwa 0.25%/min.
Eine Inkubation bei 60 o (30 min) ist ebenfalls möglich und soll helfen, proteinspezifische Unterschiede

13
Arbeitshinweis
zu minimieren.
Messungen erfolgen bei Raumtemperatur im Photometer bei 562 nm. Ein
Blindwert (proteinfreie Probe) ist von den Messungen abzuziehen. Der Muskelextrakt
wird wie die Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswert verglichen.
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Es ist strikt darauf zu achten, dass die auszuwertenden
Proteinlösungen frei sind von Reduktionsmitteln (2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol,
reduzierende Zucker; siehe Prinzip der Farbentwicklung). Chelatoren (EDTA) sind beim Ansatz der
Eichreihe zu berücksichtigen. Keine Störung durch nichtionische Detergenzien sowie die gängigen
Puffersubstanzen.
B -
ELISA-Reader (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Die Platte wird bei 60 o für
30 min inkubiert und dann im ELISA-Reader bei 562 nm ausgewertet. Zur Linearität
der Eichkurve und zur Auswertung: siehe unter A.
Eigentliche ELISA-Tests gehören zu Standardverfahren der Immunologie. Z.B. wird ein
(nachzuweisendes) Antigen an die Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden. Zugabe eines
spezifischen (ersten) Antikörpers schafft einen stationären Antigen-Antikörperkomplex. Der erste
Antikörper wird über eine ubiquitäre Sequenz (z.B. am F c -Teil) durch einen (käuflichen) zweiten
(Fusions-)Antikörper erkannt. Dieser zweite Antikörper wurde mit einem Enzym (z.B. alkalischer
Phosphatase) gekoppelt, das ein chromogenes Substrat zum Farbstoff umsetzt. Auftreten des
Farbstoffes läßt also auf Gegenwart des Antigens schließen. Im Praktikum wird die Tatsache genutzt,
dass jeder ELISA-Reader im Prinzip ein Photometer und eine bequeme Registriereinheit beinhaltet.
Allerdings wird nicht kontinuierlich, sondern in Intervallen registriert (was ist zu beachten?)
1.2.4 Fluram (Flurescamin)-Methode (Zur Zeit nicht durchgeführt)
J. Bode (1979) On the reactions of Fluorescamine with chromosomal proteins. Anal. Biochem. 99, 274-280
Prinzip: Fluorescamin, ein nichtfluoreszierendes Furanon, hat die
Eigenschaft, mit Protein-Aminogruppen zu einem fluoreszierenden
Pyrrolinon zu reagieren. Diese Reaktion hat eine Halbwertszeit von
500 ms; überschüssiges Reagenz wird in wässriger Lösung durch
Hydrolyse des Lactons in wenigen Sekunden "desaktiviert".
Abb. 1.3: Fluorescamin-Reaktion
Substanzen:
1) Fluorescamin-Lösung:
mg "Fluram" (Roche) gelöst in 100 ml trockenem Aceton

14
Arbeitshinweis
2) Puffer
0.1 M Borsäure, Na + -Salz, pH 10.
Durchführung
Man fülle große (20 ml) Szintillationsgefäße mit je 2 ml (2) und pipettiere dazu 100 µl der zu bestimmenden Lösung
mit 1-10 µg an Protein (auch wesentlich weniger ist möglich). Jedes Gefäß wird auf dem Vortex-Mixer kräftig geschüttelt und
während des Schüttelns über eine Eppendorf Mehrfachpipette mit je 200 µl (1) versetzt. Entsprechend verfahre man mit den
Eichlösungen. Die im Praktikum angesetzten BSA-Lösungen enthalten 1-10 mg BSA/ml, d.h., 100-1000 µg/100 µl, welche dann
noch 100fach verdünnt werden müssten.
Alle Proben stehen nach der Zugabe von (1) noch mindestens 15 min, dann wird ihre Fluoreszenz am Eppendorf-
Gerät gemessen, möglichst in der Reihenfolge ihres Ansatzes.
Primärfilter: 405 + 436 nm
Sekundärfilter: 470-3000 nm.
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden; ggf.
müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses
durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2).
1.2.5 Bradford-Test (Protein Assay, vertrieben von Bio-Rad)
Analytical Biochemistry 72, 248-254 (1976)
Prinzip: M. Bradford beschreibt ein Protein-Bestimmungsverfahren, das auf der
Bindung von Coomassie Brillant Blue G-250 an Proteine beruht. Der gleiche
Farbstoff wird nach einem Färbe-Entfärbezyklus auch zur Visualisierung von
Proteinen auf Polyacrylamidgelen benutzt. In Lösung funktioniert der Test nur
deshalb, weil der Chromophor infolge des Bindungsvorganges einer spektralen
Verschiebung von 465 auf 595 nm unterliegt; der Extinktionsanstieg bei 595 wird
gemessen. Infolge seiner Einfachheit und geringen Störanfälligkeit gehört dieser Test
mittlerweile zu den meistgebrauchten Routineverfahren und ist dabei, die klassische
Reaktion nach Lowry abzulösen. Störungen wurden nur aufgrund verschiedener
Detergenzien (SDS, Triton X-100 und Haushaltsreagenzien) berichtet, für welche
Korrekturen eingeführt werden müssten. Entsprechendes gilt, wenn durch
Anwesenheit stärkerer Puffer der saure pH-Wert verlassen wird. Kationen und
Zucker stören bei keiner der gängigen Konzentrationen.
Durchführung
Präparation des Protein-Reagens
70 mg Coomassie Brillant Blue G-250 oder R (Serva) werden in 50 ml 95%igem Ethanol gelöst. Zu
dieser Lösung gibt man 100 ml 85% (w/v) Phosphorsäure und verdünnt die erhaltene Mischung auf 1
l mit destilliertem Wasser. Damit werden die folgenden Endkonzentrationen erhalten:
- 0.007% (w/v) Coomassie Brillant Blue G-250
- 4.7% (w/v) Ethanol
- 8.5% (w/v) Phosphorsäure)
Das gleiche Reagens erhält man durch 1:5 Verdünnung des kommerziellen Biorad-
Reagens mit Wasser!

15
Arbeitshinweis
A - Küvetten-Verfahren
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA bzw. Lysozym (analog Kapitel 1.2.2).
Hierfür werden die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 200fach verdünnt (Endkonzentrationen
5-50 µg/ml). In Plastik-Küvetten werden 100 µl der Lösungen mit
1.9 ml des Protein-Reagens versetzt. Nach gründlicher Durchmischung (Vortex!)
stehen die Proben 30 min, bevor sie gegen einen 'blank' (aus 100 µl Puffer plus 1.9
ml Protein-Reagens) bei 595 nm vermessen werden. Der Muskelextrakt wird wie die
Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswerten verglichen.
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Bei Anwendung des Verfahrens bitte den
ungewöhnlichen Farbwert des gängigen Eichproteins BSA beachten (vergl. 1.2.6). Lysozym wäre
eine bessere Wahl.
B - ELISA-Reader
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Nach Zugabe von 100 µl
Bradfordlösung in jedes Loch können die Proben nach 2 min im ELISA-Reader bei
595 nm vermessen werden. Aus den gemessenen Eichwerten läßt sich eine
Eichgerade erstellen (zumeist bis 1.5 Extinktionseinheiten linear) und damit lässt sich
der Proteingehalt der Proben direkt ermitteln.
Bitte auch Ausführungen zur Eichgerade unter A beachten.

16
Arbeitshinweis
Abb. 1.4 Vergleich des Bradford- und des Lowry Tests hinsichtlich Empfindlichkeit, linearem Respons
und Reproduzierbarkeit
1.2.6 Zur Präzision wichtiger Proteinbestimmungsverfahren
Tabelle 1.1: Vergleich der Bradford, Lowry und Biuret Protein Assays
Alle Assays wurden an Verdünnungen von gravimetrisch eingestellten 10 mg/ml Lösungen
vorgenommen. Angegeben sind Assay-Resultate in [mg/ml]
Biuret Lowry(BCA) Bradford
1 Alkohol Dehydrogenase 5.8 5.0 7.8
2 α-Amylase 6.8 6.0 8.3
3 bovine serum albumin ( BSA) 9.7 8.4 21.1!!
4 Carbonsäure Anhydrase 8.8 8.9 13.0
5 Catalase 7.6 6.3 9.7
6 α-Chymotrypsin 9.4 11.6 7.8
7 Ovalbumin 10.2 10.1 9.4
8 Fibrinogen 6.2 7.3 7.8
9 γ-Globulin (Kaninchen) 9.4 11.8 8.0
10 ß-Galactosidase 9.5 9.9 7.9
11 Histone 9.7 9.2 15.8
12 Hämocyanin 6.6 5.4 9.2
13 Lysozym 10.4 12.6 9.9
14 Ovomucoid 7.8 8.3 5.9
15 Pepsin 9.8 12.4 4.1
16 Ribonuclease 11.8 15.9 5.3
17 Trypsininhibitor (Soja) 9.1 10.3 6.1
18 Transferrin 8.5 9.0 12.6
19 Trypsin 11.4 15. 54.9
20 Thyroglobulin 7.7 8.2 9.3
Mittel 8.81 9.61 9.20
+/-1.66 +/-3.04 +/-4.00

17
Metabolismus
2. METABOLISCHE UND ENZYMOLOGISCHE GRUNDLAGEN
2.1 Schwerpunkt dieses Praktikums: Glycolyse-Enzyme
aus der alkoholischen Gärung: Enzyme 10, 11
aus dem Stoffwechsel der Fette: Enzyme 13, 14
CH2O-P
CH-OH
CH2OH
Fette
NAD+
NADH,H+
DAP
-3,42
+0.5
-3.4
F-1.6BP
+1.83
GAP
+1.5
BPG
+0.44
+1.06
-4.7
-6
-5.72
3-PG
aus dem Phosphogluconatweg: Enzym 15
Acetat
Fetts@uren
1 :Hexokinase 10:Pyruvat-decarboxylase
2 :Phosphohexose-isomerase 11:Alkohol-dehydrogenase (ADH)
3 :Phosphofructokinase (PFK) 12:Lactat-dehydrogenase (LDH)
4 :Aldolase 13:Glycerinphosphat-dehydrogenase (GDH)
4a:Triosephosphatisomerase (TIM) 14:Acetaldehyd-dehydrogenase
5 :Glycerinaldehyd-3-P 15:Glucose-6-phosphatdehydrogenase
-dehydrogenase (GAPDH)
6 :Phosphoglycerat-kinase (PGK) NIE verwechseln:
7 :Phosphoglycerat-Mutase GAPDH mit GDH.
8 :Enolase Zahlenwerte an den Reaktionspfeilen
9 :Pyruvat-kinase sind hier ∆G o -Werte (kcal/mol) zu Kap. 5
10 :Pyruvat-decarboxylase

18
Metabolismus

19
Metabolismus
2.3 Coenzyme der Dehydrogenasen (GAPDH, GDH, LDH)
Die wasserstoffübertragenden Enzyme der Gärung enthalten als Coenzym
Dinucleotide, deren eine Nucleobase ein Pyridinderivat (das Nicotinsäureamid) ist:
NAD + (Nicotinamid-adenin-dinucleotid) und NADP + (Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat).
In den Coenzymen ist der Pyridinring glycosidisch mit Ribose verknüpft. Eine
derartige Bindung ist offensichtlich nur mit dem Pyridinium-Kation, dessen Stickstoff
protoniert ist, möglich. Über eine Pyrophosphosäuregruppierung ist das
Nicotinsäureamid-ribosid mit Adenosin verbunden:
Abb. 2.1: Nicotinamid-adenindinucleotid
Kompetitoren dieses Coenzyms
sind ADP, bzw. Moleküle, die den
Nicotinamidteil simulieren
(Salicylsäure, siehe 8.10)
In Enzymbindung wird die positive Ladung vom Stickstoff an die Position 4
delokalisiert, wo sie Anlagerung eines Hydridions (H - ) fördert; Gegenion ist ein
Proton (H + ):
Abb. 2.2 Reduktion des NAD + : Aufnahme von H -/ H +
Wie ersichtlich, wird bei diesem Vorgang die aromatische Natur des Ringes
aufgehoben (Delokalisierung erzeugt die "Racker-Bande" im GAPDH-NAD +
Komplex, d.h. eine schwache Extinktion bei 365 nm). Anlagerung des Hydridions

20
Metabolismus
erzeugt eine starke Extinktionsbande bei 340 nm.
2.4 Prinzip des Aktivitätstests für NAD + -abhängige Dehydrogenasen: der
optische Test
Die bei der Reduktion des Nicotinsäureamidringes auftretende Extinktion bei 340 nm
dient als Messparameter zur Verfolgung von Dehydrogenasereaktionen. Die
Zunahme der Extinktion je Zeiteinheit ist damit ein direktes Maß der
Reaktionsgeschwindigkeit; bei hoher Substratkonzentration ( Enzymsättigung) ist sie
der Enzymkonzentration proportional. Dieser "optische Test" ist für die (klinische)
Laboratoriumspraxis von großer Bedeutung:
Abb. 2.3: UV-Spektrum der
Pyridinnuclotide:
die reduzierte Form weist ein
Maximum bei 340 nm auf
Abb. 2.4: "optischer Test" einer
NAD + -abhängigen Dehydrogenase
die Extinktionsänderung ist gegen die
Zeit aufgetragen. Mit mehr Enzym
verläuft die Reaktion schneller
Da NADH,H + nicht nur eine Extinktionsbande (E 340 ) aufweist, sondern durch
Bestrahlen mit Licht einer Wellenlänge von 340 nm auch zur Fluoreszenz (F 495 )
angeregt werden kann, steht ein weiteres, um viele Größenordnungen
empfindlicheres Messprinzip zur Verfügung.

21
Daten
3 CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE DATEN
3.1 für NAD + und NADH,H + (molare Extinktionskoeffizienten)
NAD + : ε 259 = 17800 (cm 2 /mmol) 1
NADH,H + : ε 340 = 6300 (cm 2 /mmol)
Ist ε für eine Substanz bekannt, so kann aus einer gemessenen E die Konzentration
berechnet werden:
c =
E /ε
Es läßt sich weiter ableiten, dass die Menge an NADH,H + , die in einer Reaktion
oxidiert oder die Menge von NAD + , die in einer Reaktion reduziert wird, aus der
gemessenen Änderung der Extinktion, ∆E, berechnet werden kann.
Beispiel:
∆E 340 = 1 = 0.16 µmol NADH/ml
Unbelehrbare Personen überzeugen sich von diesem Sachverhalt mit Hilfe des
Programms "Activity"
3.2 Phosphofructokinase (ATP-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferase,
Enzym des Schrittes 3, EC 2.7.1.11)
Eine ausführlichere Würdigung regulatorischer Eigenschaften der PFK
(insbesondere des Glucagoneffektes) folgt in Kapitel 7 des Umdruckes.
Prinzip: PFK ist eine oligomere Phosphotransferase, gleichzeitig das zentrale
regulatorische Enzym der Glycolyse. PFK wird durch die Gegenspieler
Insulin/Glucagon aktiviert bzw. gehemmt. Insulin induziert das Enzym nicht nur,
sondern aktiviert es auch unter Vermittlung des cytosolischen pH-Wertes.
PFK zeigt eines der ausgeprägtesten für Enzyme beschriebenen pH-Profile, indem ihre Aktivität
innerhalb 0.1 pH-Einheiten von nahe Null auf 100% angehoben wird. Dieser Effekt kann nicht auf der
Titration eines einzelnen Aminosäurerestes zurückgehen (lineares Intervall entsprechend einer pH-
Einheit) sondern entsteht durch eine Überlagerung verschiedener pH-Effekte, so z.B. der
säureinduzierten Dissoziation in inaktive Untereinheiten.
1 Die Einheit des Extinktionskoeffizienten folgt aus dem Lambert-Beerschen Gesetz, ε = E/c × d.
Im deutschen Sprachraum wird manchmal noch die Konzentration in mol/cm 3 anzugeben. Daraus
resultiert die Dimension (1/((mol/cm 3 × cm) bzw. cm 2 /mol. Im internationalen Schrifttum (und allen
vorliegenden Ausführungen) wird die Konzentration in mol/l ausgedrückt, woraus als Dimension
1/((mol/l) × cm), 1/((mmol/cm 3 ) × cm) bzw. cm 2 /mmol folgen.

22 Daten
Abb. 2.5: Aktivitätsprofil der PFK in 50 mM Glycylglycin. Nach
T. E. Mansur und C. E. Ahlfors (1968), J. Biol. Chem. 243, 2523-2533
Ein signifikanter Insulineffekt ist die Anhebung des glycolytischen Metabolitenflusses. Offenbar durch
Stimulierung des Na + /H + -'exchangers' der Zellmembran steigt der intrazelluläre pH-Wert innerhalb
des Bereiches der PFK-Aktivierung. Hierbei hängt das konkrete pH-Intervall von der Konzentration
der Substrate und allosterischen Aktivatoren ab (W. B. Busa und R. Nuccitelli, Am. J. Physiol. 246,
R409, 1984).
Für PFK-Enzyme verschiedener Organismen wurden insgesamt über 20 Effektoren
identifiziert. Allosterische Aktivatoren sind AMP, F-6P, F-1.6BP, Mg ++ , K + und NH 4 + ,
allosterische Inhibitoren sind ATP und Citrat 2) . In Gegenwart von Mg ++ katalysiert
PFK die Bildung von F-1.6BP aus F-6P und ATP in einer praktisch irreversiblen
Reaktion (die Rücküberführung von F-1.6BP in F-6P ist Aufgabe des Fluoridsensitiven
Enzyms Fructose-bisphosphatase, EC 3.1.3.11).
Neben diesen ATP-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferasen wurden, erstmals 1974, Pyrophosphat-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferasen
in Bakterien und Pflanzen beschrieben; sie sind
dort die vorherrschende Phosphofructokinase (J. Biol. Chem. 249, 7737). Es handelt sich um eine
Gruppe reversibel arbeitender Enzyme, die F-1.6BP aus F-6P und Pyrophosphat produzieren. In
diesen Organismen liegt die Pyrophosphatkonzentration eine Größenordnung über dem K m -Wert. Die
Aktivität dieser Glycolyseenzyme ist extrem abhängig vom Regulatormolekül F-2.6BP (K d = 2.8-5.5
nM, Eur. J. Biochem. 129, 191, 1982, Physiol. Plant 92, 311, 1994).
Struktur:
(Biospektrum 5, 43-45, 1997)
Der molekulare Aufbau/die Regulation der PFK hängen vom untersuchten
Organismus und dort ggf. vom Gewebe ab:
Hefe: Hetero-Oktamer (α 4 ß 4 mit M r 130k Untereinheiten). Genduplikation führte zunächst zu einem
Fusionsprotein, weitere Genduplikation sodann zu α- und β-Untereinheiten. Jede Untereinheit besitzt
in der N-terminalen Hälfte ein katalytisches Zentrum. In den C-terminalen Hälften entwickelten sich
aus den (ursprünglich katalytischen) Bindungsstellen allosterisch regulierte Zentren.
Muskel, Erythrozyten: Assoziation (= Aktivierung) abhängig von der Proteinkonzentration, der
Konzentration an ATP/F-6P (senkt/fördert) sowie dem pH-Wert (alkalische pH-Werte fördern).Homobzw.
Heterotetramere mit M r 340k Untereinheiten. Spezifische Aktivität bis zu 158 units/mg (J. Biol.
Chem. 243, 2523-2533, 1968). Beim Menschen führt ein Defekt im Gen für die homo-tetramere
Muskel-PFK zur Glykogenspeicherkrankheit "Taruiś disease". Die auf das Doppelte bis Dreifach
2 "PFK1" wird in allen Geweben, in unterschiedlichem Ausmaß, reguliert durch
- " energy charge" (ATP+0.5ADP/(AMP+ADP+ATP)) +/-
- NADH -
- G-1.6DP +
- F-2.6BP ++ (!)
- cAMP (via F-2.6BP) -
- Citrat -

23
Daten
gesteigerte Glykogenkonzentration im Muskel führt zu Muskelleiden nach Anstrengung und zu
hämolytischen Symptomen.
Leber: Ein Vergleich mit dem Muskelenzym ergibt Unterschiede im regulatorischen Verhalten
hinsichtlich ATP, (stärkere Inhibition), Citrat, PEP, Creatin-P, 2-PG, 3-PG (geringere Inhibition) sowie
AMP und ADP (geringere De-inhibition). Die spezifische Aktivität beträgt 1/50 des obigen; vergl. J.
Biol. Chem. 246, 245 (1971).
3.3 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12),
Enzym des Schrittes 5
M. Lazdunski Curr. Top. Cell. Reg. 5, 268 (1972), Worthington Enzyme Manual
Prinzip: Die Vorwärtsreaktion der GAPDH beinhaltet drei Substrate (GAP, NAD + ,
P i ). Die oxidative Phosphorylierung von GAP erfolgt in zwei Schritten. Im ersten
Schritt reagiert der Aldehyd mit dem Cystein des aktiven Zentrums zum
Hemithioacetal, welches zum Thioester-Intermediat oxidiert wird. Im zweiten Schritt
wird das 3-Phosphoglycerol-Enzym phosphorolytisch zum BPG gespalten.
Das Enzym liefert klassische "steady-state"-Kinetiken mit allen Substraten
(einschließlich beider Oxidationsstufen des Coenzyms), jedoch sind die aktiven
Zentren nicht unabhängig voneinander: sowohl NAD + als auch NADH,H + zeigen bei
ihrer Bindung negative Kooperativität (Bode et al. 1975, Biochemistry 14, 1146). Wie auf Grund
der tetrameren Struktur zu erwarten, bindet das Enzym vier Moleküle des
Coenzyms, jedoch sind deren Bindungskonstanten weit voneinander verschieden.
Die ersten beiden Moleküle werden so fest gebunden, dass ihre Dissoziationskonstante
durch herkömmliche Verfahren nicht zu bestimmen ist, die folgenden
beiden Moleküle zeigen geringere Affinitäten (d.h. höhere Dissoziationskonstanten).

24
Daten
An diesem Beispiel wurde erstmals das Phänomen der "negativen Kooperativität"
beobachtet und analysiert.
Struktur: M r = 144 000
Vier identische Untereinheiten mit je M r 36k bzw. 330 Aminosäuren. Im Polypeptid
am aktiven Zentrum gibt es zwei Thiole, eines mit außergewöhnlicher Reaktivität.
Die Coenzymbindung hängt ferner mit einem reaktiven Lysinrest zusammen.
Physikalische Daten des Apoenzyms:
Kaninchenmuskel: E 280 1% = 8.15; E 280 /E 260 = 2.2; pH I = 8.2
Hefe: E 280 1% = 8.6; E 280 /E 260 = 2.15
Aktivatoren:
EDTA, Cystein, DTT als Thiol-Schutzreagentien, NAD +
Dissoziation/Proteolyse
Inhibitoren:
als Stabilisator gegen
Alle Agenzien, die die Oxidation des reaktiven Thiols fördern. Schwermetallionen,
pCMB, IA, o-Iodosobenzoat. ATP und cAMP als kompetitive Inhibitoren fördern die
Dissoziation.
Michaelis-Konstanten [mM] bei pH 8.5, 25 o für das Muskelenzym (K. D. Kulbe
(1969), Dissertation, Universität Hannover)
GAP NAD + Phosphat Arsenat
0.05 0.04 0.3 0.07
3.4 Pyruvatkinase Enzym des Schrittes 9
Literatur: Worthington Enzymes; F. J. Kayne in “The Enzymes”, P.D. Boyer ed., pp353
Prinzip: PK ist ein Schlüsselenzym im Glycogen-Katabolismus, das ATP durch
Gruppenübertragung von PEP erzeugt. Substrate sind neben ADP auch GDP, IDP,
dADP, UDP, CDP und dCDP. Größere Spezifität besteht hinsichtlich des
Phosphatdonors.
Besonderes Interesse besteht an genetischen Varianten, die in Verbindung mit ererbten Anämien
gebracht werden. Im Anabolismus (Gluconeogenese) wird die Überführung von Pyruvat in PEP über
Pyruvatcarboxylase und PEP-Carboxykinase erzielt, so dass an diesen Stellen regulatorische
Enzyme zu erwarten sind.
Eigenschaften: PK (M r = 237k) ist ein tetrameres Enzym aus vier identischen Untereinheiten
mit je M r = 57k. Die Dissoziation zu Dimeren ist möglich. Erstes
beschriebenes Enzym mit absoluter Erfordernis für monovalentes Kation (K + ). Die
Aktivität hängt ferner von Mg ++ ab; für beide Kationen sind spezielle Bindungsplätze
vorhanden und dem [Mg ++ ] wird regulatorische Bedeutung beigemessen. Falls [ATP]
> [Mg ++ ], wird eine Inhibition gemessen. Kann dies ein physiologisch bedeutsamer
Mechanismus sein? Die Bindung beider Kationen erfolgt mit leichter Kooperativität.

25
Daten
Der K + Effekt ist strikt mit dem des F-1.6BP gekoppelt, das als ´feedforward́-Aktivator
fungiert und Kooperativität für PEP (aber nicht für ADP) hervorruft.Dieser
Mechanismus gilt als ein wichtiger Schalter für den Übergang der Gluconeogenese
zur Glycolyse.
Das Enzym wird auch in vivo durch ATP inhibiert. Dessen Kompetition mit
ADP und PEP läßt einen gemeinsamen Phosphatbindungsplatz vermuten. Phe
wurde als nichtkompetitiver Inhibitor beschrieben und zwar mit Hill-Koeffizienten die
zwischen pH7 und 8 von 0.85 auf 2 steigen PK war übrigens das erste Protein, für
welches ligandeninduzierte Konformationsänderungen durch Trp-Differenzspektren
nachgewiesen wurden.
3.5 Lactatdehydrogenase, Enzym des Schrittes 12
Lexikon Biochemie, 2. Auflage 1982, Verlag Chemie
Prinzip: LDH, Benannt nach der thermodynamisch ungünstigen Rückreaktion des
Substrates Milchsäure (Lactat) zu Pyruvat. Absolut spezifisch für L(+) Lactat. Die
höchsten LDH-Aktivitäten weisen Herzmuskel und Leber auf. Da das Enzym ein
Tetramer aus vier 35k Untereinheiten ist, treten organspezifisch fünf isomere
Isoenzyme aus der M- bzw. der H-Kette auf (Kapitel 8.10). Die Isoenzyme lassen
sich aufgrund verschiedener pH I -Werte elektrophoretisch trennen, wobei das H 4
Enzym am stärksten negativ geladen ist. Für das 'tuning' der Glycolyse und des
Citratcyclus ist die unterschiedliche Regulation durch Pyruvat und NAD + wichtig, zum
analytischen Nachweis dient vereinfachend die unterschiedliche Hemmbarkeit durch
Pyruvat-Analoge (Kapitel 8.10). Die H 4 und H 3 M-Formen sind ferner extrem
thermolabil (Inaktivierung durch 5 Min bei 65 o ).
LDH dient zur Diagnose des Herzinfarktes und der Hepatitis, da bei diesen
Krankheitsbildern der Serumgehalt des entsprechenden Isoenzyms stark erhöht ist.
Gereinigte LDH dient im gekoppelten optischen Test zur Messung anderer
Enzymaktivitäten wie PK, Enolase, Transaminasen, sowie zur enzymatischen
Bestimmung zahlreicher Metabolite wie ADP, ATP, L(+)-Lactat und Pyruvat.
Enzykinetische Daten:
Enzym Rind-H 4 Hühner-H 4 Rind-M 4 Hühner-M 4
K m (Pyruvat) 1.4E-4M 8.9E-5M 1E-3M 3.2E-3M
Turnover No. 49400 45500 80200 93400

26
Aktivitätstests
4. AKTIVITÄTSTESTS: GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN
4.1 Einleitung zu den Versuchen
Die Enzymmenge in Lösung oder einem Gewebeextrakt kann über eine geeignete
Umsetzungsreaktion quantitativ bestimmt werden. Diese Messung erfordert Kenntnis
über:
- die Stöchiometrie des Umsatzes
- die Gleichgewichtslage der Reaktion (Kapitel 5)
- die Erfordernis von Cofaktoren (Metallionen, Coenzyme)
- die K m -Werte für Substrat(e) und Cofaktoren (Kapitel 8)
- das pH-Optimum
- ein möglichst direkter, einfacher Assay, basierend auf dem Verschwinden
des Substrates ("[S]-Fall") oder Entstehen des Produktes
("[P]-Fall")
- die thermische Stabilität bei der Temperatur des Assays
Wann immer möglich, erfolgt der Test bei Substrat- und Cofaktorsättigung
(Reaktionsordnung 0, bezogen auf Substrat), am optimalen pH-Wert und bei 25 o C.
Unter diesen Bedingungen hängt die Reaktions-Anfangsgeschwindigkeit nur von der
Enzymkonzentration ab (vergl. Kapitel 2.4 und Abb. 4.1B) 3 .
Die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umsetzung ergibt sich durch die Steigung
der Tangente an den Ursprung (t=0, P=0), denn nur hier entspricht die
Substratkonzentration noch dem eingesetzten Wert [So]. Das korrekte Legen einer
Tangente ist für den Experimentator die Hauptschwierigkeit bei enzymkinetischen
Messungen und bestimmt häufig den Ausgang des Versuchs (vergl. Abb. 4.1 und Kap. 9).
Um hier die Willkür etwas zu nehmen, wurde das Programm V0 entwickelt, das die
enzymatische Umsetzung aufgrund der integrierten Michaelis-Menten Beziehung
nachvollzieht und hieraus die Anfangssteigung errechnet.
Zumeist ist die Messung der Produktentstehung ("[P]-Fall") genauer durchzuführen
als die des Substratumsatzes (["S-Fall"), denn bei Sättigung stellt sich letztere als
kleine Differenz großer Werte dar. Reaktionsprodukte misst man durch Trennverfahren,
chemische Nachweisverfahren, spektroskopische oder fluorimetrische
Messungen. Die spektroskopischen Verfahren ermöglichen eine kontinuierliche
Registrierung des Substratumsatzes und sind - wenn anwendbar - immer
vorzuziehen.
3 hier ist sicherzustellen, dass das Enzym nicht das durchaus gängige Phänomen einer "
Substratinhibition" (Verlangsamung des Umsatzes bei sehr hohen Substratkonzentrationen
durch Besetzung sekundärer Bindungsplätze) zeigt.

27
Aktivitätstests
Abb. 4.1: Zeit-Umsatzkurven enzymkatalysierter Reaktionen ("[P]-Fall").
A- Die Anfangssteigung ergibt sich entweder durch Zeichnen einer Tangente an den Ursprung oder durch Kurvenanpassung
(Kap. 9 und Abb. 4.2). Die Graphik zeigt, wie aus der źero-time tangent́ der Substratumschlag je Minute (für [So], d.h. die
vorgelegte Substratkonzentration) aus der Produktentstehung (ṕroduct/miń) abzuleiten ist. Hat der Schreiber die
vorgeschlagene Grundeinstellung, so entspricht 1 min einem Vorschub von 6 cm (1mm/sec).
B - Invertase-katalysierter Umsatz für Saccharose-Konzentrationen von 5.2 mM bis 333 mM; nach Michaelis und Menten (1913).
Ordinatenwerte hier: optische Drehung, proportional zur Produkt (Glucose- plus Fructose-) Konzentration. Abszisse: Zeitachse
(min). Weitere Auswertung: siehe Abb. 8.1B.
Abb. 4.2: Konstruktion einer Tangente an den Ursprung aus der im Programm "V0" erhaltenen
Anfangssteigung (Vo = 21.4). In diesem Fall entspricht 1 Einheit auf der x-Achse 21.4 Einheiten auf der
y-Achse
Nach internationaler Vereinbarung definiert man die Einheit ("unit") enzymatischer Aktivität
als jene Menge des Proteins, die unter optimalen Reaktionsbedingungen, jedoch bei 25 o ,1
µMol Substrat je Minute umsetzt (alternative Definitionen: Kapitel 4.10.1). Die spezifische

28
Aktivitätstests
Aktivität sind dann die Enzymeinheiten je Masseneinheit [mg] an Protein; dies ist gleichzeitig
ein nützliches Reinheitskriterium, welches hilft, den Fortgang von Reinigungsoperationen zu
beurteilen. ́τ́, die ́ turnover numbeŕ (auch " Wechselzahl", " molare Aktivität" oder kcat)
bezeichnet die Zahl der Substratmoleküle, die je Zeiteinheit (zumeist: Sekunde) von einem
Enzymmolekül umgeschlagen wird. Die turnover number von Enzymen kann über viele
Größenordnungen schwanken; das aktivste bisher beschriebene Enzym ist Carbonsäureanhydratase
(100 000 Substratmoleküle je Sekunde; 10 7 fach beschleunigt gegenüber
der unkatalysierten Reaktion).
4.2 Versuch A0: Präparation des Muskelextraktes
5 g gefrorener Kaninchenmuskel werden im Virtis-Homogenisator in
1) 100 ml EDTA (50 mM) pH 8.4 (mit NaOH)
zerkleinert. Man zentrifugiert das Homogenat (SS34 Rotor, 10000 Upm, 5 min), bestimmt den
Proteingehalt des Überstandes nach einem geeigneten Verfahren (Kapitel 1.2), verdünnt ihn
mit 1) im Verhältnis 1:10 und führt an dieser Lösung die Enzymtests A1.1-A7.3 durch. Dabei
sind sowohl die Gesamtaktivitäten einer Reaktionskette (Aldolase-TIM-GAPDH bzw. PGK-
GAPDH) zu messen als auch die Einzelaktivitäten durch Zusatz geeigneter Hilfsenzyme (vgl.
Kapitel 2.1). Durch einen Vergleich der Volumenaktivitäten soll bei gekoppelten Tests jenes
Enzym ermittelt werden, welches die jeweilige Reaktionskette limitiert.
4.3 Versuch A1.1: Aktivitätstest für Lactat-Dehydrogenase: "Vorwärtsreaktion" 4
Obgleich dieses Enzym nach seiner Fähigkeit benannt worden ist, Milchsäure zu
Brenztraubensäure (pyruvic acid) zu oxidieren, ist beim glycolytischen Enzym das
Gleichgewicht so sehr in Richtung der Milchsäurebildung verschoben, dass die Mehrzahl der
Testverfahren auf diesem Vorgang beruhen. Dies ist die zweite Stelle im Glycolyse-Schema,
an dem mit Vorteil der optische Test angewendet werden kann (d.h., Registrierung des mit
der NADH, H + -Umsetzung verbundenen Abfalls der E 340 ).
Substanzen:
1) Puffer:0.03 M Na-phosphat, pH 7.4
(hergestellt durch Mischen von 0,03 M NaH 2 PO 4 und 0.03 M Na 2 HPO 4 oder durch NaOH-Titration von
einer konzentrierteren NaH 2 PO 4 -Lösung, die dann auf ihr Endvolumen gebracht wird)
2) 50 mM Na-pyruvat
3) 4.8 mM NADH
4 Als "Vorwärtsreaktion wird in diesem Praktikum die Reaktionsrichtung in der Glycolyse definiert.
Schreibergeschwindigkeit für alle Kinetiken: 60 mm/min d.h. 1 mm/s (geräteabhängiger
Richtwert)

29
Aktivitätstests
Man versetze 2.7 ml Testpuffer (1) mit 100 µl glycolytischer Lösung und eiche das
Spektralphotometer auf E 340 = 0. Nach Zusatz von 100 µl NADH kann die Reaktion
durch 100 µl Na-pyruvat (2) gestartet werden. Aus der Anfangsgeschwindigkeit der
Reaktion errechne man die Volumenaktivität an LDH [µmol/ml Lösung x min] sowie
die spezifische Aktivität der Lösung [µMol/mg Protein x min]. Siehe das
Rechenbeispiel, Kap. 4.10.
4.3.2 Versuch A1.2: Aktivitätstest für Lactat-Dehydrogenase:
"Rückwärtsreaktion"
Literatur: I. Gutmann in "Methoden der enzymatischen Analyse II (1974), H.U. Bergmeyer Hrsg., pp.
1510, Verlag Chemie
Lactat-Dehydrogenase katalysiert die Reaktion
deren Gleichgewicht weit auf der linken Seite liegt (K = 4x10 -5 für 25 o C und pH 7). Zur
quantitativen Dehydrierung von Lactat müssen die Reaktionsprodukte aus dem
Gleichgewicht abgefangen werden. Protonen werden durch ein alkalisches
Reaktionsmedium gebunden, Pyruvat wird als Hydrazon abgefangen. Somit lautet die
Gleichung:
Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion beträgt bei 25 o und pH 9,5 etwa 0.1.
Substanzen:
1) Puffer: 0.34 M Hydrazin 5
0.45 M Glycin, pH 9,5
2) 30 mM NAD +
3) 50 mM Lactat
4) Vergleichspuffer: 0.45 M Glycin, pH 9,5
5) 4.8 mM NADH (aus A1.1)
6) 50 mM Na-Pyruvat.
Man fülle eine QS-Küvette mit 2.7 ml des Puffers 1, gebe 100 µl der konzentrierten
glycolytischen Lösung zu und eiche das Photometer auf E 340 = 0. Enthält der
5 Vorsicht: Hydrazin wird heute als Carcinogen eingestuft

30
Aktivitätstests
Muskelextrakt bereits Lactat, so ist nach Zusatz von 100 µl NAD + ein leichter Anstieg
der E 340 zu verzeichnen (bitte notieren für spätere Kalkulationen, vgl. Versuchsgruppe
B). Anschließend startet man den Aktivitätstest durch Zupipettieren von 100 µl Lactat-
Lösung und registriert den Anstieg der E 340 .
Zusatzversuch: (Zur Gleichgewichtslage der LDH-Reaktion)
Man führe einen analogen Versuch für die Aktivität der LDH in der Vorwärtsreaktion
durch, d.h., man verwende statt der Lösungen (1), (2) und (3) die Lösungen (4), (5)
und (6). Falls die Reaktion unter diesen Bedingungen für eine Registrierung zu schnell
abläuft, ist der Muskelextrakt zu verdünnen und der Verdünnungsfaktor zu notieren:
die enzymatische Aktivität ist eine Funktion der Enzymkonzentration.
- Wie ist das Verhältnis der Aktivitäten (d.h. Anfangsgeschwindigkeiten) für
die Vorwärts-/Rückwärtsreaktion bei pH 9,5?
- Wie hoch ist der Endwert der E 340 in der Rückwärtsreaktion bei
Verwendung von Puffer (4) statt Puffer (1)? (Bitte notieren für spätere
Auswertung in Versuchsgruppe B).
4.4 Versuch A2: Kombinierter Test für PGK und GAPDH (Rückwärtstest)
Die Reaktionen von GAP zu BPG und 3-PG sind reversibel und können, z.B. durch
Anwendung eines großen ATP-Überschusses in Richtung der GAP-Bildung gelenkt
werden. Läßt man Muskelextrakt unter Zusatz von ATP und NADH,H + auf 3-PG
einwirken, so ist, bei Gegenwart von PGK und GAPDH eine Oxidation des NADH,H +
zum NAD + zu verzeichnen. Dieser Prozeß läßt sich am Absinken der E 340 verfolgen
(optischer Test, s. Kapitel 2.4).
Substanzen:
1) Testmischung: 1 mM EDTA
8 mM MgSO 4
80 mM TRA-HCl, pH 7.6, dann
12 mM 3-PG
2) 4.8 mM NADH
3) 75 mM ATP
4) für Einzeltests: Hilfsenzym 6 (je 5 µl Kristallsuspension, s. Fußnote).
Man fülle eine QS-Küvette mit 2.7 ml Testmischung und setze 100 µl Muskelextrakt
zu. Man stelle das Spektralphotometer auf 340 nm und justiere mit der angegebenen
Mischung den Nullpunkt (E 340 = 0). Sodann setze man 100 µl NADH,H + -Lösung zu
6Hilfsenzyme sind bei der gegebenen Aufgabenstellung jeweils für Einzeltests nötig. Beispiele:
Versuch
A2:Hilfsenzym PGK zum GAPDH-Test und vice versa
A3:Hilfsenzym Aldolase zum GAPDH-Test und vice versa
A5:Hilfsenzym TIM zum Aldolasetest

31
Aktivitätstests
(Endkonzentration 0.16 mM NADH,H + , d.h. E 340 = 1). Man starte die Reaktion durch
Zugabe von 100 µl ATP-Lösung und registriere den Abfall der E 340 . Aus der
Anfangsgeschwindigkeit dieser Reaktion errechne man die Volumenaktivität sowie die
spezifische Aktivität. (Siehe das Rechenbeispiel in Kapitel 4.10).
4.5 Versuch A3: Kombinierter Test für Aldolase und GAPDH
Der optische Test der Aldolase setzt die Verfügbarkeit zweier Hilfsenzyme, TIM und
GAPDH voraus; er arbeitet auch in Gegenwart von nur GAPDH, basiert dann aber nur
auf der Umsetzung des Nebenproduktes der Aldolspaltung, GAP.
Substanzen:
1) Testmischung: 5 mM Dithiothreitol (DTT)
0.36 mM EDTA
65 mM Tris-HCl, pH 7.4
2) 0.48 M Na 2 HAsO 4
3) 30 mM NAD +
4) 25 mM F-1,6-BP
5) ggf. Hilfsenzyme 6) (je 5 µl Kristallsuspension).
Man versetze 1.7 ml der Testmischung nacheinander mit 1 ml F-1,6-BP (4), 100 µl
glycolytischer Lösung und 100 µl Na 2 HAsO 4 (2). Das Photometer wird mit dieser
Mischung auf E 340 =0 geeicht. Durch Zugabe von 100 µl NAD + (3) kann die
enzymatische Reaktion gestartet und durch Messung der E 340 verfolgt werden.
Auswertung wie zuvor.
4.6 Versuch A4:Aktivitätstest für Aldolase (Hydrazonbildung, zur Zeit nicht durchgeführt)
Falls ein "UV-fähiges" Photometer zugänglich ist: Ein Testverfahren, das unabhängig von Hilfsenzymen ist, beruht darauf, dass
GAP und DAP, die Produkte der enzymatischen Reaktion, mit Hydrazin (vergl. Fußnote 5 ) zu den entsprechenden Hydrazonen
umgesetzt werden können. Dieser Folgeschritt verschiebt das Gleichgewicht der enzymatischen Reaktion ganz auf die Seite der
Triosephosphate:
Die Entstehung des GAP-Hydrazons kann dabei durch seine Lichtabsorption bei 240 nm verfolgt werden.
Eine Einheit enzymatischer Aktivität ist hier willkürlich definiert als eine Extinktionsänderung ∆E 240 = 1 je min. Welche Angabe
wäre erforderlich, um die Aktivität nach internationaler Vereinbarung in (µmol GAP/min . mg Aldolase) darstellen zu können?
Substanzen:
1) Substrat: 25 mM Fructose-1,6-diphosphat in H 2 O, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung)
2) Reagenz: 3.5 mM Hydrazin-Sulfat in 0.1 mM EDTA, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung).
Man fülle eine QS-Küvette nacheinander mit 500 µl Substrat (1), 2 ml Reagens (2) und 500 µl H 2 O, eiche mit dieser Mischung

32
Aktivitätstests
das Photometer auf E 240 = 0 und verfolge während einiger Minuten den leichten, unspezifischen Anstieg der E 240 in der
Testküvette (sog. "non-enzymatic rate", d.h. spontane Aldolspaltung). Sodann versetze man die Testküvette mit 100 µl der glycolytischen
Lösung (s. oben) und registriere den nun erfolgenden Anstieg der E 240 ; die Eigenabsorption des Zusatzes bei 240 nm ist
zu berücksichtigen. Nach Abzug der "nonenzymatic rate" von der "enzymatic rate" kann nun die Volumenaktivität (units/ml)
errechnet werden. Bei der endgültigen Definition der Startextinktion ist die Eigenextinktion der glycolytischen Lösung zu berücksichtigen
Anmerkung: dieser Versuch dient der Demonstration eines Aktivitätstests, der nicht auf dem optischen Test beruht. Bei
Schwierigkeiten in der Durchführung bediene man sich eines "UV-fähigen" Photometers, ggf. sogar eines gereingten Enzyms
4.7 Versuch A5:Kombinierter Test für Aldolase und Triose-P-Isomerase (TIM)
Der Test beruht auf einem Hilfsenzym, welches Glycolyse und Fettsynthese koppelt,
d.h., DAP reduziert: Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase.
Substanzen:
1) Testmischung von Versuch A3.
2) 25 mM F-1,6-BP von Versuch A3.
3) 4.8 mM NADH,H + von Versuch A2.
4) Hilfsenzyme 6) je 5 µl Kristallsuspension.
Man versetze 1.7 ml der Testmischung (1) nacheinander mit 1 ml F-1,6-BP, 5 µl
Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase und 100 µl NADH,H + (3). Zusatz von 100 µl
glycolytischer Lösung leitet die Reaktion ein. Bei Verwendung als Aldolasetest ist TIM
als Hilfsenzym einzusetzen.
- Der Test eignet sich schlecht zur Bestimmung der TIM-Aktivität. Warum?
- Stimmt die Aldolaseaktivität mit der unter A3 ermittelten überein? Würden
Sie dies erwarten?
4.8 Versuch A6:Aktivitätstest für Triosephosphat-Isomerase (TIM)
Die Anordnung ist ähnlich wie in A5, benutzt jedoch GAP als Substrat.
Substanzen:
1) Testmischung von Versuch A3
2) D-GAP, ca. 7.5 mM
3) 4.8 mM NADH,H + von Versuch A2
4) Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Kristallsuspension).
Man versetze 2.7 ml der Testmischung (1) nacheinander mit 5 µl der Kristallsuspension
(4), 100 µl GAP (2) und 100 µl NADH,H + (3). Ein eventuelles Absinken
des E 340 -Wertes zu diesem Zeitpunkt ist ein Maß für die spontane Umwandlung von
GAP zu DAP (kontrollieren!). Zusatz von 100 µl glycolytischer Lösung wird das

33
Aktivitätstests
Absinken der E 340 beschleunigen und ist (nach eventueller Korrektur) ein Maß der
TIM-Aktivität.
4.9.1 A7.1: Darstellung des GAPDH-Substrates (GAP)
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe. Wird durch die Assistenten erledigt.
Prinzip: Es soll aus einer chemisch stabilen Vorstufe, dem Bariumsalz der D,L-Glycerinadehyd-3-Phosphorsäure (GAP-R) das
instabile Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) gebildet werden. Austausch der Ba 2+ -Ionen und Zerlegung des (säurelabilen) Acetals
erfolgen in einem Schritt an einem Kationenaustauscher (Dowex-50 W-Harz).
Substanzen: 1) Dowex-50-Ionenaustauscher (H + -Form); 2) D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat-diäthylacetal, Ba ++ -Salz (GAP-R).
In einem Zentrifugierglas werden 7,5 g Dowex-Harz und 500 mg GAP-R in 25 ml H 2 O suspendiert. Unter ständigem Schütteln
wird die Suspension 3.0 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt, wobei GAP in Lösung geht. Man kühlt das Gemisch im
Eisbad, zentrifugiert und entfernt GAP vom Harz durch Dekantieren. Um eine möglichst vollständige Extraktion des GAP aus dem
Harz zu erreichen, wird letzteres mindestens noch einmal in je 2 ml H 2 O suspendiert und zentrifugiert. Die Überstände werden
vereinigt.
Wird diese Vorschrift genauestens eingehalten, so enthalten die vereinigten Überstände mindestens 150 µmol D,L-GAP (d.h., 75
µmol des natürlichen, D-konfigurierten) Isomers. Die Lösung ist für mindestens vier Tage völlig stabil; Gefrieren erhöht die
Lebensdauer beträchtlich und wird empfohlen.
4.9.2 Versuch A7.2: Standardisierung der GAP-Lösung (enzymatisch)
Prinzip:
Erfaßt wird nur das D-Isomer des GAP. Näheres zum optischen Test unter 2.4.
Substanzen:
1) 0.2 M Tris-HCl, pH 8.5
2) 0.17 M Na 2 HAsO 4
3) 0.2 M L-Cystein
4) 0.6 M NaF
5) 0.02 M NAD +
6) GAPDH-Lösung mit 750 µg Protein je ml (einstellen gemäß Kapitel 1.2.1)
In eine Küvette pipettiert man: 1.5 ml Tris-HCl Puffer, 300 µl Na 2 HAsO 4 , 300 µl H 2 O,
50 µl Cystein, 600 µl NaF, 100 µl GAPDH und 100 µl GAP. Man schreibt die Nullinie
und startet die Reaktion durch Zugabe von 50 µl NAD + . Endvolumen: 3ml.
Achtung: durch erhebliche Instabilität von verdünntem GAP ist es erforderlich, die Reaktion bald nach
GAP-Zugabe zu starten.
Kalkulation: E 340 x 3/6.3 = µmol GAP in Küvette 1, d.h., in 100 µl der zu
standardisierenden GAP-Lösung. 7
7 Die Richtigkeit dieses Ansatzes folgt am einfachsten aus folgenden Überlegungen:

34
Aktivitätstests
4.9.3 Versuch A7.3: Aktivitätstest für GAPDH
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe (nicht am 1. Praktikumstag)
Prinzip: vergl. Kapitel 2.1
Substanzen:
1)Testpuffer: 40 mM Triäthanolamin
50 mM Na 2 HPO 4
0.2 mM EDTA, pH 8.5 (HCl)
2) 7.5x10 -3 M NAD +
3) 7.5x10 -3 M D-GAP
4) GAPDH mit einer Protein-Konzentration von 200 µg/ml (Ermittlung gem. Kapitel
1.2.1)
Man fülle eine Küvette wie folgt:
1) Testpuffer 2.7 ml
2) GAP 8 0.1 ml
3) GAPDH 100 µl
Man läßt diese Mischung einige Minuten äquilibrieren, justiert das Photometer auf
E 340 =0 und startet die Reaktion durch Zugabe von 0.1 ml NAD + . Der Wert ∆E 340 je min
ergibt sich dann aus der Reaktions-Anfangsgeschwindigkeit.
Nur wenn NAD + und GAP in sättigender Konzentration vorliegen (überprüfen!), ist
v proportional der spezifischen Aktivität des Enzyms:
spez. Akt. = v [µmol NAD + /(min×mg Enzym)]
Die spezifische Aktivität wird in sog. "enzyme units" angegeben (Definition Kapitel
4.10). Ist Substratsättigung nicht zu erreichen, so ist, bei Kenntnis der K m -Werte von
NAD + und GAP, die folgende Korrektur anzubringen (Biochem. J. 92, 578 (1964)):
- bei einer (angenommenen) End-extinktion von 1.6 ergibt die Kurzformel
1.6 × (3/6.3) = 0.76 µmol GAP in 100 µl
7.6 µmol GAP in 1 ml
7.6 mmol GAP in 1 l;
Sie haben also eine 7.6 mM Lösung angesetzt, die in etwa den Erwartungen entspricht.
- Gegenprobe: Zur Standardisierung wird die gewünschte 7.5 × 10 -3 M Stammlösung 100:3000
verdünnt. Das ergibt eine 2.5 × 10 -4 M Küvettenfüllung.
1 mol/l -> ∆E = 6300
2.5 . 10 -4 mol/l -> ∆E = 1.58
8 Man vergegenwärtige sich, dass die Endkonzentrationen von NAD + und GAP in der Küvette 7.5x10 -
3 x100/3000 = 0.25x10 -3 M (0.25 mM) betragen.

35
Aktivitätstests
spez. Akt.
S: Konzentrationen an NAD + bzw. GAP.
= v . (1 + K m /S) NAD+ × (1 + K m /S) GAP
4.10 Rechenbeispiel zu Aktivitätsbestimmungen: Volumenaktivität und
spezifische Aktivität
4.10.1 Definitionen
Derzeit gibt es zwei Systeme zur Benennung von Enzymaktivitäten:
- Die 1961 eingeführte "enzyme unit", definiert als diejenige Enzymmenge, die
unter Standardbedingungen je min ein µmol Substrat umsetzt (dies ist die hier
verwendete Definition. Es gibt Anzeichen dafür, dass sie sich bei Enzymologen
halten wird).
- Die 1972 definierte SI-Einheit "katal" (Symbol "kat"), das ist die Enzymaktivität,
ausgedrückt als mol umgesetztes Substrat je sec.
Die beiden Systeme sind folgendermaßen miteinander gekoppelt:
1 kat = 6 × 10 7 enzyme units
1 enzyme unit = 16.67 × 10 -9 kat
= 16.67 nkat.
4.10.2 Rechnung
Aus dem Lambert-Beerschen Gesetz
E = ε × c × d
folgt für 1 cm-Küvetten (d = 1)
E/ε = c
d.h. aus der Extinktion E einer Substanz und über den Proportionalitätsfaktor ε
(molarer Extinktionskoeffizient) lässt sich ihre molare Konzentration ermitteln. (Einheit:
mol/l / mmol/ml).
Analog lässt sich aus einer Kinetik, d.h. der Extinktionsänderung ∆E, der
Substratumschlag ∆S während eines Zeitintervalls bestimmen:
∆E/ε = ∆c
NADH,H + hat einen molaren Extinktionskoeffizienten ε 340 = 6300. Bildung von 1
mol/l (1 mmol/ml) wäre also mit einer Änderung der Extinktion, ∆E 340 = 6300
verbunden. Angenommen, bei einem Aktivitätstest findet man eine Änderung der
∆E 340 = 1,8 je min, so entspricht dies:
1.8/6300 = 2.86 x 10 -4 mmol/(ml . min)
d.h., einer Volumenaktivität von 0.286 µmol/(ml . min) oder (gebräuchlicher) 0.286
enzyme units pro ml Lösung in der Küvette. Die Aktivität im Ausgangsextrakt ergibt
sich dann durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor (30 für einen Prototyp-

36
Aktivitätstests
Ansatz, in dem 100 µl Extrakt auf 3 ml aufgefüllt werden; 30 × 0.268 = 8.04 enzyme
units pro ml Ausgangsextrakt)
Man hat ferner bestimmt, dass der Ausgangsextrakt 3 mg Protein je ml enthält.
Daraus folgt dass 8.04 enzyme units auf 3 mg Protein zurückgehen, was einer
spezifischen Aktivität von
8.04 ÷ 3 = 2.86 enzyme units pro mg Protein
entspricht
Sollten immer noch Schwierigkeiten beim Nachvollziehen dieser Kalkulationen auftreten, so kann zur
Unterstützung das Programm "Activity" herangezogen werden, dem dieser Rechengang zugrunde
liegt.

37
Standardenthalpie
5. ZUR FREIEN STANDARDENTHALPIE (∆G o ) UND FREIEN ENTHALPIE (∆G)
CHEMISCHER REAKTIONEN
5.1 Einleitung zu den Versuchen
Die Änderung der freien Enthalpie, ∆G, einer enzymatischen Umsetzung des Typs
aA + bB __ > cC + dD
lautet:
c
o C ⋅ D
∆G = ∆G + RT⋅ln [ ] [ ]
a
[ A] ⋅[ B]
Hierin sind [A] bis [D] die molaren Konzentrationen der entsprechenden Metabolite
und a bis d ihre Stöchiometrien. R steht für die Gaskonstante {R=8.31434 . 10 -3
[kJ/(mol . grd)], früher: R=1.98717 . 10 -3 [kcal/(mol . grd)]}, T die absolute Temperatur
(zumeist 298 K entsprechend 25 o C) und ∆G o die noch abzuleitende freie
Standardenthalpie. 9
Die Gleichgewichtseinstellung der Reaktion folgt bei beliebigen Ausgangskonzentrationen
[A] bis [D] dem Kriterium minimaler freier Enthalpie. Im Gleichgewicht
ändert sich ∆G definitionsgemäß nicht mehr und mit ∆G=0 wird erhalten:
d
b
c d
c
o C ⋅ D
o C ⋅ D
0 = ∆G
+ RT⋅ln [ ] [ ] ∆G
=−RT
a b
a
[ A] ⋅[ B] ; ln[ ] [ ]
[ A] ⋅[ B]
Mit der aus dem Massenwirkungsgesetz folgenden Definition der Gleichgewichtskonstanten,
K = ([C] c [D] d )/([A] a [B] b ) ergibt sich vereinfachend
d
b
∆G o =−RT ln K
Hierdurch wird illustriert, dass sich ∆G o
prinzipiell aus der entsprechenden
Gleichgewichtskonstanten bei derselben Temperatur ermitteln läßt. Somit ist die
Änderung der freien Standardenthalpie eine charakteristische thermodynamische
Konstante einer jeden Reaktion.
Es ist wichtig, die unterschiedlichen Definitionen der Parameter ∆G (Änderung der freien Enthalpie)
und ∆G o (Änderung der freien Standardenthalpie) genau zu beachten und zu verstehen. Hier soll der
Unterschied anhand einer Analogie plausibel gemacht werden:
so wie der pK-Wert einer schwachen Säure bei gegebener Temperatur eine Konstante ist, ist ∆G o die
Konstante einer jeden Reaktion. Auf der anderen Seite ist ∆G mit der Konzentration der
Reaktionspartner veränderlich, etwa so, wie sich der pH-Wert in der Lösung einer schwachen Säure
mit den Konzentrationen der Protonendonoren und -akzeptoren ändert.
Gleichheit zwischen ∆G und ∆G o herrscht nur bei (hypothetischen) Konzentrationen von 1 M und zwar
9 Schon an dieser Stelle zeichnet sich allerdings ab, dass ∆G o = ∆G wird, wenn alle Edukte und
Produkte in Konzentrationen von 1 mol/l vorliegen und somit ln([C] c. [D] d /[A] a. [B] b ) gleich Null wird.
Aufgrund des Vorzeichens kann aus ∆G o also die (hypothetische) Reaktionsrichtung bei 1 M
Konzentrationen aller Reaktionspartner abgelesen werden.

38
Standardenthalpie
für alle Edukte und Produkte. Dies entspricht der Bedingung pH = pK wenn Protonendonor und -
akzeptor gleichkonzentriert sind.
Damit wird klar, dass ∆G derjenige Parameter ist, welcher die Reaktionsrichtung
bestimmt (bei negativem ∆G liegt die Reaktionsrichtung auf der Produktseite, d.h. die
freie Enthalpie kann beim Reaktionsverlauf einem Minimum zustreben). Andererseits
kann eine durch positives ∆G o gekennzeichnete Reaktion durchaus in der
geschriebenen Richtung ablaufen, sofern die Ausgangskonzentrationen ein negatives
∆G gewährleisten.
Die obigen Zusammenhänge ermöglichen eine gegenseitige Umrechnung von
Gleichgewichtskonstanten und ∆G o -Werten und gleiches leistet auch das Programm
"G0" im Praktikums-Programmpaket. Bitte, überzeugen Sie sich von der qualitativen
Richtigkeit der folgenden Zusammenhänge (∆G o -Angaben nach neuer SI-
Konvention, d.h. in kJ/mol)
Tabelle 5.1: Gleichgewichtskonstante und ∆G o : nur die Daten für exergonische
Reaktionen (negatives ∆G o ; unter Standardbedingungen spontan ablaufend) sind
gezeigt.
K
∆G o
1 0
10 - 6
10 2 -11
10 3 -17
10 4 -23
10 5 -29
Bei Umkehrung der Vorzeichen, d.h. für endergonische
Reaktionen, gelten für K die Kehrwerte. Bitte bedenken Sie,
dass exergone Reaktionen diese Eigenschaft haben können,
weil sie exotherm verlaufen (∆H negativ) oder weil sie
Entropie-getrieben sind (∆S positiv). Diese Zusammenhänge
folgen aus dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik in der
Form
∆G = ∆H - T∆S
5.2 Freie Standardenthalpien von Glycolysereaktionen in kcal/mol für pH 7
Vergl. Schema in Kap. 2.1; Angaben dort nach herkömmlicher Konvention, d.h. in
kcal/mol.
5.3 Freie Standardenthalpie der GAPDH- und GDH-Reaktionen
5.3.0 Aufgabe B0: Umrechnung von Gleichgewichtskonstanten, ∆G o - und ∆G-
Werten
- Berechnen Sie aus den ∆G o Werten im Glycolyseschema (S. 18) die
Gleichgewichtskonstanten für sämtliche Reaktionen der Glycolyse und
der alkoholischen Gärung (Reaktionen 1-12). Für Ihre Bemühungen steht
das Computerprogramm "G0" zur Verfügung.
- Die freie Standardenthalpie, ∆G o , der Aldolasereaktion beträgt +5.7
kcal/mol und ähnelt damit jenem für die LDH-Rückwärtsreaktion
- Wie groß wird die freie Enthalpie ∆G bei 1E-3M (d.h. 1mM) Konzentrationen
aller Reaktionspartner (F-1.6BP, GAP, DAP)? Setzen Sie für

39
Standardenthalpie
R . T den Wert 1.99E-3 . 298 [kcal/mol] bzw. 8.31E-3 . 298 kJ/mol
- kann die Reaktion unter physiologischen Bedingungen ablaufen, d.h. wie
groß sind die Gleichgewichtskonzentrationen von DAP und GAP, wenn
Sie F-1.6DP als 1E-3 ansetzen?
5.3.1 Versuch B1: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GAPDH-
Reaktion:
Reaktion (Gleichgewichtseinstellung)
Definitionen 10 :
∆G o = - RT ln K
= - 2.478 lnK (kJ/mol)
= - 0.592 lnK (kcal/mol)
K = [1,3-BPG] . [NADH,H + ]
[P i ] . [GAP] . [NAD + ]
Materialien: Siehe Versuch A7.3 (Puffer von pH 8.5 und zusätzlich von pH 7.0, s.u.);
GAPDH ist aus der Kristallsuspension (Fa. Boehringer) anzusetzen.
Durchführung: Zunächst sind die Konzentrationen der Stammlösungen für NAD + und
GAP zu bestimmen:
-für NAD + unter Zugrundelegen des molaren Extinktionskoeffizenten, ε 259 = 17800
-für GAP durch enzymatische Standardisierung (Versuch A7.2). Sollwerte der
Stammlösungen jeweils: 7.5x10 -3 M
10 Es ist nicht ganz leicht zu verstehen, warum auch im vorliegenden Fall (Zahl der Edukte ungleich
der Zahl der Produkte) die Gleichgewichtskonstante K als dimensionslose Größe gesehen wird und nur
wenige Lehrbücher nehmen sich dieser Problematik an (z.B. N.C Price & R.A. Dwek (1984) in
"Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists", S. 21f; I. Mills et. al. (1988)
Quantities, Units and Symbols in Physical Chemistry, Blackwell; R. A. Alberty & A. Cornish-Bowden
(1993) TIBS 18, 288-291). So lautet die vollständige Definition der Gleichgewichtskonstanten im
vorliegenden Falle
K = [1,3-BPG]/[1,3-BPG] o . [NADH,H + ]/[NADH,H + ] o
[P i ]/[Pi] o . [GAP]/[GAP] o . [NAD + ]/[NAD] o
das heißt, für jeden Reaktionspartner wäre korrekt der Quotient aus seiner
Gleichgewichtskonzentration und seinem Standardzustand anzusetzen. Standardzustände werden
normalerweise als Lösungen mit 1 mol/l unter dem Druck von 1 Atmosphäre definiert. Wenn sie somit
stillschweigend = 1 gesetzt werden, so erfordert dies doch die Angabe aller Konzentrationen in [mol/l].

40
Standardenthalpie
Man vereinigt alle Komponenten, wie unter A7.3 beschrieben (so dass [NAD + ]
und [GAP] jeweils Endkonzentrationen von 25 × 10 -5 M haben) und verfolgt den
Reaktionsablauf bis zu Ende. Aus der schließlich erreichten Extinktion bei 340 nm
ergibt sich die Gleichgewichtskonzentration von NADH,H + (ca. 1×10 -5 M, abhängig vom
pH Wert). Die Gleichgewichtskonzentration für NAD +
ergibt sich dann durch
Subtrahieren dieses Wertes von der Anfangskonzentration an NAD + (d.h. 25 × 10 -5 M).
Die Konzentration an 1,3-BPG entspricht dann zwangsläufig jener an NADH,H + und
[GAP] gleicht der Gleichgewichtskonzentration von NAD + . Infolge seiner hohen
Konzentration bleibt P i praktisch unverändert und kann zu 5000 × 10 -5 M
(entsprechend 50 mM) eingesetzt werden.
- Welchen Wert hat die Gleichgewichtskonstante der Reaktion?
- Welche "freie Standardenthalpie" folgt daraus?
- Warum kann dieser Wert sich nicht mit dem Literaturwert decken?
- Führen Sie den gleichen Versuch bei pH 7 durch und überprüfen Sie
nochmals die Übereinstimmung mit dem Literaturwert. Um messbare
Veränderungen zu erzielen kann es dabei notwendig sein, die Substratkonzentration
anzuheben. Folgerungen?
5.3.2 Versuch B2: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GAPDH-Reaktion (kinetischer Ansatz) zur Zeit nicht
durchgeführt
Unter einigen noch zu diskutierenden, vereinfachenden Annahmen ergibt sich die Gleichgewichtskonstante aus dem Verhältnis
der Geschwindigkeitskonstanten (Aktivitäten) von Hin- und Rückreaktion:
K entspr. k 2 /k- 2 (in der Definition von Kap. 8.2)
Zwischen der Gleichgewichtskonstanten und der freien Standardenthalpie besteht, wie erwähnt, der folgende Zusammenhang:
∆G o
= -RTlnK
= -2.478 ln k [kJ/mol]
= -0.592 ln K [kcal/mol] für T = 298 (25 o C)
Eine Gleichgewichtskonstante von 0.3 würde somit eine freie Standardenthalpie von
∆G o = -0.592 . ln 0.3 = -0.592 . (-1,20)
= +0.71 kcal/mol)
bedeuten: Das Gleichgewicht wäre bei 1 M Konzentration aller Reaktionspartner (GAP, 1,3-BPG, NAD + , NADH,H + und P i ) nach
links verschoben, die Reaktion wäre endergonisch (Gegensatz: exergonisch).
Materialien:
Puffer 1: 80 mM TEAxHCl (pH 7.0)
8 mM MgCl 2
12 mM 3-PG
Puffer 2: 80 mM TEAxHCl (pH 7.0)
8 mM MgCl 2
50 mM NaH 2 PO 4

41
Standardenthalpie
GAPDH:etwa 20 µg/ml, angesetzt aus einer Kristallsuspension in Puffer 1. ggf. PGK als Hilfsenzym (5 µl
Kristallsuspension)
Man bestimme die enzymatische Aktivität (d.h., die Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung!) sowohl im Vorwärtstest
(analog Versuch A7.3, jedoch bei pH 7, d.h. mit Puffer 2) als auch im Rückwärtstest (analog Versuch A2, jedoch mit Puffer 1 und
PGK als Hilfsenzym); in beiden Fällen sind 100 µl derselben (in ihrer Konzentration optimierten) GAPDH-Lösung einzusetzen.
Beachte, dass bei Anordnung B1 die Enzymkonzentration keine, die Substratkonzentration jedoch die entscheidende Rolle spielt,
während es hier (Sättigungsbedingungen vorausgesetzt) exakt umgekehrt ist.
Ziel:
Das Enzym sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtsreaktion mit maximaler Umsatzgeschwindigkeit
arbeiten zu lassen, gleichzeitig nach den in Kapitel 8.12 genannten Kriterien eindeutig auswertbare Kinetiken zu erhalten
(Stichworte: Anfangssteigung, Tangente an den Ursprung, Computersimulation). Nach Möglichkeit sollte versucht werden, den
Messbereich des Photometers zehnfach zu spreizen (Vollausschlag dann: 0.1 Extinktionseinheiten). Weiterhin können folgende
Parameter variiert werden:
- Substratkonzentrationen oberhalb eines bestimmten Wertes (hohe Konzentrationen geben häufig besser
auswertbare Kinetiken)
- Anwendung des "Hydrazin-Tricks" (Kap. 4.3.2) zum Abfangen des Produktes der Rückwärtsreaktion, d.i. GAP;
man untersuche den Einfluss von 50 mM Hydrazin in Puffer (1) (pH-Kontrolle!).
Aus dem gewonnenen Verhältnis maximaler Reaktionsgeschwindigkeiten bestimme man schließlich die Gleichgewichtskonstante
und hieraus den Wert ∆G o , dieser sollte mit dem Resultat des Versuches B1 übereinstimmen. Eventuelle Abweichungen wären
zu erklären (Stichworte: suboptimaler pH-Wert für Enzym oder Hilfsenzym; Sättigung nicht zu erreichen, K d -Werte für ES und EP
Komplex verschieden etc.).
Literaturdaten (A. Lehninger, "Biochemistry")
D-Glyceraldehyde-3-phosphate + NAD + + P i _ > 1.3-Diphosphoglycerate + NADH,H + ;
∆G o = + 1.5 kcal/mol
The overall reaction has a slightly positive value of ∆G o (+1.5 kcal . mole -1 ) and thus proceeds readily in
either direction depending on the concentration of the reactants.
5.3.3 Versuch B3: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GDH-Reaktion
Glycerinphosphat-DeHydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion:
Das Gleichgewicht der vorgeschalteten TIM-Reaktion liegt auf der Seite des DAP.
Folgende Materialien stehen zur Verfügung:
Enzyme:
Substrate:
GDH und TIM
GAP und G-3P

42
Standardenthalpie
Aufgaben: Diskutieren Sie die prinzipiellen Möglichkeiten zur Bestimmung von K und
∆G o der GDH-Reaktion. Wählen Sie (aufgrund Ihrer Erfahrungen aus B1 und B2) eine
dieser Möglichkeiten und führen Sie diese praktisch aus. Geben Sie die freie Enthalpie
für die Reaktion von DAP zu G-3P an (Vorzeichen!).
Anmerkung: Dieser Versuch fördert Ihre Kreativität. Daher gibt es keinen Pipettierplan; dieser ist im
"trial-and-error"- Verfahren zu optimieren. Ein geeigneter Puffer mit pH 7,0 ist aus dem vorliegenden
Manuskript abzuleiten und anzusetzen.

43
Metaboliten
6. BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN
BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
• NACH DER ENDPUNKTMETHODE:
6.1 Das Messprinzip
Bei der Konzentrationsbestimmung von Substraten und Coenzymen misst man im
allgemeinen nach der Endwert-Methode den gesamten Umsatz. Verläuft - was
experimentell immer angestrebt wird - die Reaktion gemäß günstiger Gleichgewichtslage
quantitativ, so ist das Anlegen von Bezugskurven überflüssig. Um die
Reaktion möglichst zu beschleunigen, arbeitet man mit relativ hohen Enzymkonzentrationen.
Gelegentlich kommt die Reaktion nicht vollständig zum Stillstand. Man
beobachtet vielmehr eine langsame, kontinuierliche Extinktionsveränderung
("Schleich-Reaktion"). Diese Extinktionsveränderung überlagert sich der gesamten
Reaktion, so dass graphisch auf die Zeit des Starts (t o ) zu extrapolieren ist. Zur
Extrapolation wartet man, bis die Reaktionsrate über 4 - 5 Min konstant bleibt, dann
verlängert man den linearen Teil der Kurve bis zur Zeit t o . Aus den Schnittpunkten mit
der Ordinate erhält man dann die wahre Extinktionsänderung, die man der
Berechnung zugrunde legt:
Abb. 6.1: Berücksichtigung einer "Schleichreaktion"
6.2 C1: Versuche am Kaninchenmuskel-Extrakt

44
Km/Ki
Versuche C1 bitte am frischen Muskelextrakt (Präparat der Gruppe 1) durchführen.
Einwaage an Muskelgewebe sowie Endvolumen erfragen!
6.2.1 Versuch C1.1:Nachweis von ATP
Während der Glycolyse werden zwei Moleküle ATP je Molekül Glucose mehr gebildet als
verbraucht (Kapitel 2.1). Der Nachweis von ATP gelingt auf der Basis des Versuchs A2 mit
den dort angegebenen Lösungen:
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.8 ml der Testmischung (1) und justiert das Photometer damit
auf E 340 = 0. Sodann setzt man 100 µl der NADH,H + -Lösung (2) zu. Zugabe von 100 µl
konzentrierter glycolytischer Lösung ergibt im Falle der Anwesenheit von ATP ein Absinken
der optischen Dichte bei 340 nm. Nach Erreichen eines minimalen E 340 -Wertes stellt man
durch erneute Zugabe von 100 µl der NADH,H + -Lösung sicher, dass dieses nicht zum
limitierenden Faktor geworden ist. Wie hoch ist die ATP Konzentration in glycolyt. Lösung?
6.2.2 Versuch C1.2:Nachweis von 3-PG
Dieser Versuch unterscheidet nicht zwischen freiem 3-PG und solchem in Bindung an
GAPDH (vgl. Formel für das Acylenzym in Kapitel 3.4 und J. Biol. Chem. 246, 780 (1971)). Neben
den Substanzen unter A2 wird benötigt:
1') Testmischung:
80 mM TEA
1 mM EDTA
9 mM MgSO 4 , pH 7.6 (mit HCl).
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.7 ml der Testmischung 1' sowie 100 µl der ATP-Lösung
3). Nach Justieren des Photometers auf E = 0 werden 100 µl NADH,H + -Lösung (2)
zugesetzt. Zufuhr von 100 µl konzentrierter glycolytischer Lösung führt zum Absinken der
Extinktion bei 340 nm, falls diese 3-PG enthält. Wie hoch ist dessen Konzentration in
glycolyt. Lösung? Wird das Ergebnis durch Folgemetabolite des 3-PG (2-PG, Pyruvat,
Lactat) beeinflusst? Überprüfen Sie dies, indem Sie 100 µl 5 mM Lösungen dieser
Metabolite zum obigen Gemisch pipettieren und Änderungen der Extinktion verzeichnen.
6.2.3 Versuch C1.3: Nachweis von DAP und benachbarten Metaboliten
Für den Nachweis werden Substanzen aus A3/A5 benötigt. Man fülle eine QS-Küvette mit
2.7 ml der Testmischung (1) und 5 µl Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Kristallsuspension).
Mit dieser Mischung eiche man das Photometer auf E 340 = 0. Durch
Zugabe von 100 µl NADH,H + (3) erreicht man E 340 = 1. Führt die Zugabe von 100 µl
glycolytischer Lösung zu einer Abnahme der Extinktion bei 340 nm? Kann diese durch
Versetzen mit 100 µl einer 75 mM ATP-Lösung noch gesteigert werden?

45
Km/Ki
Zur Ergänzung und falls die Zeit reicht:
- Ist dieser Versuch in der Lage, zwischen DAP, F-1,6-BP und den weiteren Vorläufern (Fructose-6-P,
Glucose-6-P) zu unterscheiden? D.h. erzielen Sie eine weitere Erniedrigung der E 340 -Ablesung, falls
Sie ca. 20 µl Portionen der genannten F-1,6-BP Vorläufer zufügen (Stammlösungen: 25 mM)?
- Ändern sich die Ergebnisse, falls Sie die EDTA-Konzentration der Testmischung von 0.36 mM EDTA
auf 5 mM EDTA heraufsetzen und falls dies zutrifft: warum?
Bitte die Aussagekraft der Versuche kritisch durchdenken! Bei allen Interpretationen
stets davon ausgehen, dass noch alle Glycolyse-Enzyme zugegen sind und aktiv sein
könnten.
6.2.4 Versuch C1.4: Lage des NAD + /NADH,H + -Gleichgewichtes im Muskel
Im Muskel wird das Gleichgewicht der Coenzyme durch zwei Enzyme, GAPDH und LDH
gesteuert:
Abb. 6.2 Gegenseitige Abhängigkeit der
GAPDH-und LDH-Reaktionen bei anaerober
Glycolyseführung.
Mit Ausnahme geringer Mengen NADH,H + , die
durch Glycerinphosphatdehydrogenase
(GDH)verbraucht werden, muss der Großteil an
NAD + durch die LDH-Reaktion regeneriert
werden.
Das Vorliegen von Triosephosphat-Vorstufen (Versuch C3) sowie von ATP (Versuch C1) im
Muskelextrakt schließt eine direkte Untersuchung des NAD + - bzw. NADH,H + -Gehaltes auf
Grund der obigen Kopplung der GAPDH- und LDH-Reaktionen aus: durch LDH oxidiertes
NAD + steht unmittelbar als GAPDH-Cosubstrat zur erneuten Reduktion zur Verfügung. Eine
weitere Komplikation besteht darin, dass NAD + sich innerhalb von Stunden im Muskelgewebe
zu einer Substanz "NADR" umsetzt, d.h. nur unmittelbar nach dem Schlachtvorgang
nachweisbar ist. Diesen Schwierigkeiten wird wie folgt Rechnung getragen:
- Ein Gemisch aus gleichen Anteilen NADH,H + und NAD + wird im Muskelextrakt bis zur
Gleichgewichtseinstellung belassen,
- das erzielte Gleichgewicht wird durch Zerstörung der beteiligten Enzyme fixiert. Für
die jeweilige Analyse wird dann nur die benötigte Aktivität zugesetzt.
Substanzen:
1) LDH-Puffer aus A1.1 (0.03 M Na-phosphat, pH 7.4)
2) Aldolase/GAPDH-Puffer aus A3

46
Km/Ki
3) 50 mM Na-pyruvat in (1)
4) 10 mM NADH,H + + 10 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!)
5) 0.48 M Na 2 HAsO 4 in (1)
6) 25 mM F-1,6-BP in (1)
7) Pepsin, LDH, GAPDH, TIM, Aldolase als Kristallsuspensionen.
500 µl konzentrierter Muskelextrakt werden mit 500 µl NAD + /NADH,H + -Gemisch (4) versetzt
und zur Einstellung des NAD + /NADH,H + Gleichgewichtes für 30 min temperiert (37 o ). Mit
verdünnter HCl wird sodann pH 2 eingestellt. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den
Extrakt für 30 min bei 37 o proteolytisch ab. Nach diesem Schritt stellt man pH 7.4 mit
verdünnter Ammoniaklösung ein, zentrifugiert und verwendet den Überstand zu folgenden
Analysen:
NADH,H + : 2.7 ml des Puffers (1) werden mit 5 µl LDH versetzt, damit wird das Photometer
auf E 340 =0 geeicht. Nach Zusatz von 100 µl des obigen Überstandes kann die Oxidation von
eventuell vorhandenem NADH,H + durch Zugabe von 100 µl Pyruvat (3) gestartet werden.
Man registriere den Abfall der E 340 .
NAD + : 1,7 ml der Mischung (2) werden mit 1 ml F-1,6-BP (6) und 100 µl Arsenat (5) versetzt.
Nach Zugabe von 100 µl des obigen Überstandes wird das Photometer auf E 340 = 0
gebracht. Bei Gegenwart von NAD + sollte die Zugabe der Hilfsenzyme GAPDH, TIM und
Aldolase zum Ansteigen der E 340 führen. Beim Ausbleiben einer Reaktion ist durch
Coenzym-Zugabe die Richtigkeit des Ansatzes zu überprüfen.
Bestimmen Sie den Quotienten ((NAD + )+(NADH,H + ))/((NAD + ) input + (NADH,H + ) input ), d.h.
den Anteil an Coenzym, den Sie nach der Inkubation zurückgewinnen können. Was
sagt Ihr Ergebnis aus über den Verbleib/die Stabilität dieser Coenzyme?
6.3 C2:Versuche an diversen proteinfreien Extrakten
6.3.1 C2.1 Herstellung eines Extraktes aus Kaninchenherz (zur Zeit nicht durchgeführt)
5 g Kaninchen-Herzmuskel (etwa ein halbes Herz) werden in einem Porzellanmörser mit flüssiger Luft tiefgefroren. Nach Auflegen eines
Tuches läßt sich das Gewebe zerstampfen. Man setzt einige Löffel Trockeneis sowie 50 ml 8%ige Perchlorsäure zu und verreibt die Masse
bis fast zur Homogenität (Perchlorsäure-Endkonzentration: etwa 0.6 M). Nach langsamem Auftauen steht das Gemisch für weitere 15 min
bei 0 o (gelegentlich aufrühren!). Man zentrifugiert bei 0 o für 5 min bei 10.000 Upm im SS34-Rotor. Der Überstand wird vorsichtig (!!) mit
einer Lösung aus 1 M TEA (freie Base)/6 M KOH neutralisiert, gegebenenfalls zur Klärung nochmals zentrifugiert.
6.3.2 C2.2:Deproteinierung des Skelettmuskelextraktes durch Pepsin (z.B. zu Versuch C1.4)
Analog Versuch C1.4 werden 500µl konzentrierter Kaninchen-Skelettmuskelextrakt (von Gruppe 1) im Eisbad mit 0.1 M HCl auf
pH 2 gebracht. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den Extrakt für 30 min bei ca 4 o proteolytisch ab. Danach stellt man mit verdünnter
Ammoniaklösung pH 7.4 ein. Nach Zentrifugieren weist man die Zerstörung enzymatischer Aktivitäten anhand eines robusten Enzyms nach
(z.B. über einen LDH-Test analog Versuch A1.2).

47
Km/Ki
6.3.3 C2.3:Metabolitengemisch unbekannter Herkunft und Zusammensetzung
Wir geben Ihnen eine proteinfreie Metabolitenlösung, deren Herkunft und damit Zusammensetzung nur uns
bekannt ist.
6.3.4 Versuch C2.4.1:Energiereiche Phosphate: ATP
Abb. 6.3: Analyseschema "energiereiche Phosphate": ATP und Creatinphosphat.
CP, Creatin-phosphat; CPK, Creatin-phosphokinase
Prinzip:
Puffer:
0.1 M TEA (freie Base), pH 7.6 (mit HCl)
10 mM MgCl 2
2 mM EDTA
2.5 mM Hydrazin (kein Hydrazinsulfat!)
Hilfsenzyme:
PGK und GAPDH
als gemischte Kristallsuspension oder Extrakt
Creatinphosphokinase (CPK)
30 mg in 1 ml H 2 O gelöst
2.7 ml Puffer werden mit 5 µl Hilfsenzymen sowie 100 µl (optimieren!!) des zu
analysierenden Extraktes versetzt. Nach Eichen des Photometers auf E 340 = 0 setzt man 100
µl 4.8 mM NADH,H + (aus A1) zu. Dann startet man die Reaktion durch 100 µl 360 mM 3-PG.
Falls NADH,H + die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der
ATP-Konzentration.

48
Km/Ki
Versuch C2.4.2:
Energiereiche Phosphate: Creatin-Phosphat (CP)
Prinzip:
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.1 bestimmt man im gleichen Testansatz Creatinphosphat
(CP). Die Reaktion sollte sich direkt, nach Zusatz von 10 µl Creatin-Phosphokinase starten
lassen. Falls NADH,H + die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein
Maß der CP-Konzentration.
6.3.5 Versuch C2.4.3:Energiemangel-Metabolite: ADP
Abb. 6.4: Analyseschema "Energiemangel-Metabolite": ADP, AMP und Creatin.
CR, Creatin; MK, Myokinase, PK, Pyruvat-kinase, CPK, Creatin-phosphokinase
Prinzip:
Puffer: 0.1 M TEA, pH 7.6
3 mM MgCl 2
7 mM KCl
PEP:
50 mM
Hilfsenzyme: Pyruvatkinase (PK), LDH, Myokinase (MK): Kristallsuspensionen
CPK (Lösung aus C.4.2)

49
Km/Ki
Zu 2.7 ml Puffer gibt man 100 µl des zu analysierenden Extraktes (optimieren!), je 5 µl LDH
und PK und justiert das Photometer auf E 340 = 0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H +
(aus A1) startet man die Reaktion mit 100 µl PEP-Lösung. Falls NADH,H + die Reaktion nicht
limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der ADP-Konzentration.
Versuch C2.4.4:- AMP
Prinzip:
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.3 bestimmt man im gleichen Testansatz die AMP-
Konzentration. Die Reaktion sollte sich durch 5 µl Myokinase (MK-Kristallsuspension) starten
lassen. Bitte bei der Rechnung berücksichtigen: aus 1 AMP werden 2 ADP. Falls NADH,H +
die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der erneute Abfall der E 340 ein Maß der AMP-
Konzentration.
Versuch C2.4.5:- Creatin
Prinzip:
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.4 wird der gleiche Ansatz zur Bestimmung von Creatin
vorbereitet. Man stellt mit einer gesättigten K 2 CO 3 -Lösung vorsichtig (!) pH 9.2 ein, versetzt
nochmals mit 100 µl PEP sowie mit 100 µl 75 mM ATP (ADP-frei, aus A2) und justiert das
Photometer mit dieser Mischung auf E 340 =0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H + läßt
sich die Reaktion durch 100 µl (3 mg) Creatinphosphokinase (CPK) starten 11 . Falls NADH,H +
die Reaktion nicht limitiert, ist der Abfall der E 340 ein Maß der Creatin-Konzentration. Zu
dessen Berechnung bitte Verdünnung (durch pH-Einstellung etc.) berücksichtigen.
11 Das Gleichgewicht der CPK-Reaktion hängt stark vom pH-Wert ab; im schwach Sauren liegt es auf der
Seite des Creatin, im Alkalischen auf der des Creatin-phosphats. Da die Wechselzahl des Enzyms gering ist
(25000 mol/(mol . min) bei 38 o ) sind größere Mengen zum schnellen Reaktionsablauf nötig.

50
Km/Ki
BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN BIOLOGISCHEN
FLÜSSIGKEITEN
• NACH DER KINETISCHEN METHODE
6.4.1 Das Messprinzip
Die Sättigungsfunktion der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit (Kapitel
8.1) gehorcht der Michaelis-Menten Beziehung (Kapitel 8.2).
v
= V max × S
K m + S
Für den Fall, dass die zu bestimmende Substratkonzentration gegenüber K m
vernachlässigbar ist (S

51
Km/Ki
Spezies Luciferase Luciferin Emissions-Wellenl./ Art
__________________________________________________________
Bakterien M r 80k FMNH 2 +RCHO 495nm/kontinuierl.
Dinoflagell. M r 420k Polypyrrol 465nm/Blitz
Coelentrate M r 21k Colenterazine 460nm/ "
Photinus M r 100k Benzthiazole 560nm/ "
Die Luciferine verschiedener Spezies variieren grundlegend. Entsprechend gibt es verschiedene Luciferasen,
die als Peroxidasen, Mono- oder Dioxigenasen arbeiten können. Die verschiedenen mechanistischen
Gegebenheiten ermöglichten eine Fülle neuer analytischer Verfahren zum Nachweis von Energieträgern (ATP,
NADH,H + , FMNH 2 ), Kationen (Mg ++ , Ca ++ , Sr ++ ) und (aufgrund ihres ATP-Gehaltes) zu Bakterienzähllungen:
Spezies
Reaktionsbedingungen
_______________________________________________________
Bakterien NADH,H + und FMNH 2
Photinus (Leuchtkäfer)
und Renilla (Federkoralle) ATP, Mg ++
Aequora (Qualle) Photoprotein, Ca ++ , Sr ++
Cypridina (Muschelkrebs) -
In diesem Praktikum soll der Nachweis von ATP und ATP-Vorstufen durch Biolumineszenz
demonstriert werden. Vor Aufkommen der Luminometer konnten hierfür mit einigem Erfolg
die für Radiolumineszenzmessungen entwickelten Szintillationszähler eingesetzt werden, da
beide Methoden auf der Zählung von Lichtblitzen je Zeitintervall beruhen. Es wird gezeigt,
dass für diesen Test rohe Leuchtkäfer-Extrakte eingesetzt werden können, da diese sowohl
Luciferase als auch Luciferin (leider auch einiges an ATP) mitbringen.
6.5 Biolumineszenzmessungen mit einem Luminometer 12
6.5.1 Versuch C3.0:Luciferin/Luciferasepräparat
Puffer:
25 mM Glycylglycin (pH 7.8 mit 0.1 M KOH)
15 mM MgSO 4
Luciferin/Luciferasereagens:
50 mg getrocknete Leuchtorgane (Sigma FFT, Firefly Lantern, desiccated tails, 500 mg DM 46,92 oder Sigma
FFW, desiccated whole Fireflies, 5 g DM 85,--) werden mit Hilfe eines 15 ml Potter-Homogenisators und 5 ml
eiskaltem 0.1 M Arsenat für mindestens 5 min sorgfältig homogenisiert und in Intervallen gevortext. Das
Homogenat wird dann zur teilweisen Klärung zentrifugiert (8000 xg, 3 min). Die Überstände füllt man mit 0.1 M
Arsenat auf 50 ml auf und setzt 500 mg MgSO 4 x 7 H 2 O zu. Bei 4 o hält sich diese Lösung für mehrere Tage.
Achtung: Mit der Zugabe von MgSO 4 wird die Luciferin-Luciferasereaktion gestartet, d.h., endogenes ATP
verbraucht. Die Lösung sollte nicht unmittelbar verwendet werden, da sonst sehr hohe Blindwerte resultieren
können.
6.5.2 Versuch C3.1:Eichreihe für ATP
Daten für ATP: M r = 507.2; ε 259 = 15 400; Verdünnungslösung: 5 mM MgCl 2 in Wasser.
12 Zu diesem Versuch gibt es eine Vorläufer-Vorschrift, die auf den Gebrauch (die 'Zweckentfemdung') eines
Szintillationszählers zugeschnitten war. Derzeit sind wir auf solchen Behelf nicht angewiesen.

52
Km/Ki
1 mg ATP wird in 5 ml Verdünnungslösung aufgenommen und mit wenigen Tropfen
0.1 M NaHCO 3 neutralisiert; die Konzentration wird durch Extinktionsmessung bei 259 nm
bestimmt (E 259 für diese Lösung: ca. 5; zu überprüfen an einer 1:10 Verdünnung). Durch
weiteres Verdünnen wird hieraus eine 0.4 µM ATP-Stammlösung hergestellt (endgültiger
Verdünnungsfaktor etwa 1000).
Eichreihe:
ATP-Stammlösung (µl)
Verdünnungslösung (µl)
10 990(1)
20 980(2)
30 970(3)
...
...
100 900(10)
Diese Lösungen sind im Gerät vorzulegen. Luciferin/Luciferasereagenz wird auf Knopfdruck
injiziert; die Zahle der Lichtblitze wird im Verlauf von 10 s automatisch summiert und
angezeigt (Integralmessung).
- Welches ist die Messgrenze des hier beschriebenen Verfahrens, d.h., welche
Menge (in g) an ATP liefert noch eine Ablesung, welche um den Faktor 10 über
dem Blindwert liegt?
- Liefern die obigen Ablesungen eine Eichgerade? Erklären Sie eventuelle
Abweichungen.
6.5.3 Versuch C3.2: Energiereiche Phosphate: ATP und Creatin-Phosphat
Zur Analyse steht nach Kapitel 6.3.3 (Versuchsnummer C2.3) ein Metabolitengemisch mit
ATP und Creatinphosphat im millimolaren Bereich zur Verfügung. Beide energiereichen
Phosphate sollen quantifiziert werden, wofür die folgenden prinzipiellen Möglichkeiten
denkbar sind:
a - Sequenzielle Messung von ATP und CP. Bestimmung von ATP wie unter 6.5.2. Nach Ablauf der Luciferasereaktion (überprüfen!)
Creatinphosphat mit Hilfe der CPK-Reaktion (C2.4.2) zu ATP umsetzen. Quantifizierung des so generierten ATP durch erneutes Starten
der Luciferase/Luciferinreaktion.
b - Parallele Bestimmung von ATP und Creatinphosphat. Im Falle des CP-Ansatzes wird zunächst freies ATP mit Hilfe der stark
exergonen Hexokinasereaktion abgebaut. Nach Inaktivierung der Hexokinase wird ATP über die CPK-Reaktion (C2.4.2) aus CP generiert
und dann wie oben vermessen.
Substanzen: 10x TEA-Puffer pH 7.6
0.5 M Triethanolamin-hydrochlorid, eingestellt mit NaOH
10x Magnesiumchlorid
0.1 M MgCl 2
10x Glucose
0.5 M Glucose
Hexokinase: Kristallsuspension
3.5 ml des Gemisches mit je 500 µl 10x TEA, 10x Magnesiumchlorid und 10x Glucose versetzen. 3µl Hexokinasesuspension zusetzen und
Ansatz für 30 min bei Raumtemperatur belassen. Abwesenheit des ATP überprüfen, dann Enzymaktivitäten durch Erhitzen (5 min im
kochenden Wasserbad) zerstören. Ansatz sofort im Eisbad abkühlen, CP durch CPK-Reaktion (C2.4.2) in ATP überführen und darüber wie
oben quantifizieren.

53
Km/Ki
c - Summenbestimmung CP und ATP. Neben der üblichen Ermittlung des ATP-Wertes
wird ein Parallelansatz der CPK-Reaktion (C2.4.2) unterworfen. Nach adäquater
Verdünnung dient dieser Ansatz der Bestimmung von Gesamt-ATP. Der CP-Wert folgt durch
Subtraktion des Wertes für ursprünglich freies ATP.
Bitte Vor-und Nachteile dieser Ansätze diskutieren und die eigene Wahl begründen.
Alle Verdünnungen so wählen, dass die Ablesungen in den unter 6.5.2 ermittelten
Messbereich fallen.

54
Km/Ki
7 REGULATORISCHE ENZYME
7.1 Phosphofructokinase: ein Schlüsselenzym bei der Regulation des Metabolitenflusses
im Glycolyseweg
Die doppelte Rolle der Glycolyse besteht in der Bereitstellung von Bausteinen für andere
Biosynthesewege ("Sammelphase") und der Gewinnung chemischer Energie in Form von
ATP ("Gewinnphase"). Bei aerobem Stoffwechsel stellt auch NADH,H + eine Form
chemischer Energie dar (bei anaerobem Verlauf wird NAD + durch die LDH-Reaktion
regeneriert).
Zur Erfüllung dieser Bedürfnisse muss der Glucoseumsatz an solchen Enzymen reguliert werden, die
irreversibel arbeiten und spezifisch für die Glycolyse sind. Kandidaten hierfür sind die Reaktionen der
Phosphofructokinase (PFK) und der Pyruvatkinase (PK); die Hexokinasereaktion scheidet aus, da ihr Produkt,
G-6P ein multifunktioneller Metabolit ist (in wiefern?).
Als wichtigste Kontrollstelle gilt heute die PFK. Das Leberenzym, ein 340 kDa Tetramer, wird
durch höhere ATP-Konzentrationen inhibiert, d.h. der K m -Wert des Substrates F-6P wird
erhöht. Offenbar wird gleichzeitig ein kooperatives Bindungsverhalten induziert 13
Versuch D2):
(vergl.
Abb.7.1: Allosterische Regulation der PFK durch ATP.
Wie ATP sollen auch Citrat und PEP hemmend wirken,
während AMP den inhibitorischen Effekt dieser
Metaboliten unterbindet. Zusammengefasst reduzieren
"Energieüberschusssignale" die Aktivität während
Energiemangelsignale diesem Effekt entgegenwirken.
Diese Eigenschaften der PFK bilden den wichtigsten Aspekt molekularer Erklärungen des
Pasteur-Effektes, d.h. einer historischen Beobachtung wonach bei Umschaltung auf aeroben
Stoffwechsel der Metabolitenstrom in der Glycolyse gedrosselt wird um eine gleichbleibende
"energy charge" der Zelle zu gewährleisten.
Ein "neues" Regulatormolekül der Glycolyse wurde 1980 durch H.-G. Hers und E. van
Schaftingen entdeckt: F-2.6BP (Eur. J. Biochem. 159, 359), welches nach Art eines "dritten
Messengers" zur Fortpflanzung von "Hungersignalen" entlang der Signaltransduktionskette
Glucagon -> cAMP in der Leber dient (Kap. 7.2).
13 Kooperativität gegenüber F-6P scheint unter den Bedingungen aufzutreten, die eine Dissoziation des
Enzyms in seine Untereinheiten fördern, das sind eine hohe [ATP] und ein leicht acider pH-Wert (pH 6.9, cf. J.
Biol. Chem. 243, 2523-2533, 1968). Da F-6P die Aktivierung/Assoziation der Protomeren zur aktiven Form
fördert, ergibt sich ein kooperatives Ansprechen des Enzyms auf dieses Substrat.

55
Km/Ki
7.2 Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus von Effektoren bei oligomeren
Enzymen: Beispiel der Phosphofructokinase der Glycolyse
http://de.wikipedia.org/wiki/Phosphofructokinase
Abb. 7.2:
PFK - Wichtige Regulationsprinzipien; nur in vitro (Enzymkinetik) fällt F-1.6BP in Konzentrationen an, die eine
Selbstaktivierung (Bindung statt 2.6.BPG) zur Folge haben können
PFK besitzt ihr katalytisches Zentrum am N-Terminus, das regulatorische Zentrum am C-
Terminus eines durch Genduplikation entstandenen Fusionsproteins. Beide Hälften zeigen
infolgedessen Sequenzhomologien, unterlagen aber, entsprechend ihrer Aufgabe,
getrennten Optimierungsprozessen (Nature 326, 811 (1987)).
Der katalytische Teil bindet die Substrate F-6P und ATP. ATP nimmt bei höheren
Konzentrationen auch einen (niederaffinen) Bindungsplatz am regulatorischen Teil ein und
wirkt von dort aus als allosterischer Inhibitor. Diese Funktion teilt es mit weiteren endogenen
Energieüberschusssignalen der Zelle (NADH,H + und Citrat). Sind hingegen
Energiemangelsignale (AMP, ADP) vorhanden, so wird das Enzym allosterisch aktiviert.
Solange AMP und ADP vorherrschen, determinieren sie das Geschehen.
Seit längerem ist bekannt, dass PFK1 nicht nur durch eines seiner Substrate (ATP)
inhibierbar ist, sondern auch durch eines seiner Produkte (F-1.6BP) in vitro aktiviert werden
kann ("verkehrtes Enzym"). In der Zelle tritt der letztere Effekt vermutlich nicht auf, da F-

56
Km/Ki
1.6BP durch Aldolasetätigkeit nie die erforderliche "steady-state" Konzentration erreicht.
Relativ neu ist der Befund dass ein Isomeres, das F-2.6BP, ein physiologischer allosterischer
Aktivator ist. F-2.6BP vermittelt Hungersignale (Glucagon, Adrenalin), die vom
Organismus ausgesandt werden.
F-2.6BP ist das Produkt einer weiteren, spezialisierten Phosphofructokinase (PFK II) 14 . PFK II gehört zu den
interkonvertierbaren Enzymen, d.h. ihre Aktivität wird durch Proteinkinase A und damit indirekt durch
hormonelle Signale reguliert. So findet man, dass Glucagon die PFK II der Leber abschaltet, wodurch F-2.6BP
nicht mehr verfügbar ist. Hierdurch kommt der Metabolitenstrom der Glycolyse an PFK1 zum Erliegen. Der
resultierende G-6P Stau wird durch Überführung in Glucose abgebaut, die als Neutralmolekül an den
Blutkreislauf abgegeben werden kann. Das Glucagonsignal "zu geringer Blutzucker" ist damit beantwortet 15 .
Das gegenläufige (Insulin-) Signal "zu hoher Blutzucker" wird offenbar über ein extrem pHabhängiges
Aktivitätsprofil realisiert (Kapitel 3.2). Die Aktivierung der PFK1 beinhaltet nicht
nur Konformationsänderungen der individuellen Untereinheiten, sondern auch Aggregatbildung
zu höheren Oligomeren [(C.R) n ]; dabei scheint der Wert n von der Spezies, auch vom
Organ, abzuhängen.
7.3 Versuch D1: Zur Regulation der Phosphofructokinase (Enzym des Schrittes 3)
Phosphofructokinase spricht auf die Energiebilanz der Zelle an, der Metabolitenfluss durch
die Glycolyse wird bei Umschalten auf aeroben Abbau an dieser Stelle gedrosselt.
Allgemeine Vorbemerkung: als regulatorisches Enzym entspricht PFK nicht den Michaelis-Menten Voraussetzungen
und beginnt nicht mit der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit. Tangenten an den Ursprung können hier nicht über
Programm "V0" ermittelt werden (das M.-Menten-Verhalten voraussetzt). Hier ist zunächst die Steigung des auf die
typische „lagphase“ folgenden linearen Astes zu vermessen und den Rechnungen zugrunde zu legen (siehe aber unter
D3).
Substanzen:
1) Testmischung 4 mM Dithiothreitol
5 mM MgCl 2
50 mM Imidazol-HCl, pH 7.4 (7.2-7.6, in diesem Puffer jedoch keinesfalls
unter 7.1 16 )
2) 150 mM ATP in (1)
3) 150 mM Citrat in (1)
4) 25 mM Fructose-6-phosphat (pH der Lösung kontrollieren!!)
14 Bitte beachten, dass PFK1 und PFK2 keine Isoenzyme im strengen Sinne sind, da sie keine identischen,
sondern nur verwandte Reaktionen katalysieren.
15 Wie bei Tieren, aktiviert F-2.6BP auch bei Pflanzen die Glycolyse und hemmt die Gluconeogenese. Bei
aktiver Photosynthese wird DAP erzeugt und P i verbraucht, wodurch PFK-2 gehemmt wird: die Konzentration
an F-2.6BP nimt ab. Nimmt die Photosynthese hingegen ab, steigt
[F-2.6BP], wodurch die Glycolyse stimuliert wird und die Energieerzeugung übernimmt (Lehninger “Prinzipien
der Biochemie (1994) pp 727).
16 vergl. Kapitel 3.2

57
Km/Ki
5) 4.8 mM NADH,H +
6) Hilfsenzym Glycerin-3-P-Dehydrogenase (5 µl GDH-Kristallsuspension; da PFK das "
Flaschenhalsenzym" der Glycolyse darstellt, sind bei Verwendung des Muskelextraktes
Trisosephosphat-Isomerase und Aldolase als weitere Hilfsenzyme entbehrlich)
7) 100 µl Muskelextrakt als Quelle für Phosphofructokinase
Solange gereinigte Phosphofructokinase erhältlich war (bis 1997) wurden 10-50 µl Kristallsuspension auf 1 ml H 2 O verwendet.
Die Lösung wurde auf 20 mM DTT eingestellt (20 µl einer 1M Lösung von DTT ad 1 ml) 17 . Stabilitätsprobleme werden durch
Verwendung des vollständigen Muskelextraktes umgangen (warum?). Allerdings ist der Extrakt vor Versuchsbeginn von
"störenden" Metaboliten (insbesondere ATP) zu befreien (warum?).
A) Einfluss der ATP-Konzentration 18
Depletieren des Muskelextraktes(ATP): Aufgrund der Versuchsgruppe B ist bekannt, dass
der Muskelextrakt bereits ATP, aber auch Glucose, G-6P, DAP und 3-PG enthält. Bei Zusatz
von GDH und NADH,H + können 3-PG und DAP über den Schritt 3 (Kap. 2.1) in der GDH
Reaktion abgezogen werden; dabei sollte auch ATP umgesetzt werden (Glucokinase-, PFK-
Reaktionen aber auch PGK-"Rückwärtsreaktion"). Verglichen mit dem zugesetzten
Hilfsenzym (GDH) sollte die Wirkung endogener LDH von untergeordneter Bedeutung sein,
damit Neusynthese des ATP zu vernachlässigen sein. Bei Vorversuchen wurde gezeigt,
dass die Depletierung im Pipettierschema beim F-6P-Schritt gelungen ist (Abb. 7.3): Die
Reaktion wird erst durch Zugabe externen ATPs (und nicht schon bei Zugabe von F-6P)
gestartet. Die spezifische PFK-Reaktion verrät sich aufgrund des sich charakteristisch
beschleunigenden Umsatzes (Abbau inhibitorischer ATP-Konzentrationen, Entstehung von
stimulatorischem F-1.6BP, das in der Küvette die Rolle von F-2.6BP übernehmen kann):
Pipettierplan:
Testmischung (1) 2625 2595 2545 2445
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100
NADH,H + (5) 150 150 150 150
- Warten: Depletion -
F-6P (4) 100 100 100 100
- Extinktion stabil? -
ATP (2) 20 50 100 200
17 Phosphofructokinase wird zwischen pH 7 und 8 extrem instabil; nur in Gegenwart von
Substraten/Substratanalogen (2 mM ATP, 10mM Phosphat) bleibt sie bei pH 7 für >10 Minuten unverändert;
andernfalls wird sie innerhalb von 2 Minuten inaktiviert. J. V. Passoneau & O. Lowry (1962) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 7, 10-14.
18 K. Uyeda & E. Racker (1965), J. Biol. Chem. 240 4682-4688, Fig. 4

58
Km/Ki
Abb. 7.3: Muskelextrakt wird durch Zugabe von NADH,H + und GDH als Hilfsenzym an ATP, 3-PG und DAP
depletiert. Ausbleiben einer weiteren Reaktion nach F-6P Zugabe zeigt Abwesenheit von ATP. Die PFK-
Reaktion kann dann durch Zugabe von ATP gestartet werden.
Fertigen Sie Diagramme an, in denen Sie die Endkonzentrationen an ATP (mM, Abszisse)
gegen die höchste Reaktionsgeschwindigkeit (∆E/min) auftragen.
- zur Abschätzung des K m -Wertes für ATP verwenden Sie statt 2) bitte ATP-
Lösungen von ca. 5 mM.
Damit können Sie den Bereich erfassen, in welchem Erhöhung der ATP-Konzentration Steigerung der
Umsatzgeschwindigkeit bewirkt
- Ermitteln Sie die präzisen K m und K is- Werte für ATP mit Hilfe des Programmes
Composit
(Option [I]nhibition; [S]ubstratinhibition;
- geben Sie mögliche Gründe an für die "lagphase" zu Beginn der Reaktion;
B) Einfluss von Citrat (3) 19 :
Testm.(1) 2495 2475 2445 2395 2295
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100 100
Citrat (3) - 20 50 100 200
NADH,H + (5) 150 150 150 150 150
F-6P (4) 100 100 100 100 100
- Warten: F-6P-Depletion; NADH,H + ausreichend? -
ATP (2) 150 150 150 150 150
Fertigen Sie Diagramme an, in denen Sie die Endkonzentrationen an Citrat (mM, Abszisse)
gegen die höchste Reaktionsgeschwindigkeit (∆E/min) auftragen.
- Schätzen Sie den K i -Wert für Citrat;
19 Die Citrathemmung tritt nur vor dem Hintergrund einer erhöhten (bereits inhibitorischen) ATP-Konzentration
(8 mM) auf: A. Parmeggiani & R. H. Bowman (1963), Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 268-273, Tab. 1

59
Km/Ki
- Fertigen sie eine Auftragung der Endkonzentration an Citrat (mM; Abszisse)
gegen dessen relative Hemmung an. Ermitteln Sie die Dissoziationskonstante
für Citrat (die hier dessen Inhibitionskonstante gleichen sollte) über das
Programm Composit
(Option [S]ubstratkonzentration [H]yperbol); das Verfahren wird unter D3 für ein
anderes (komplexeres) Inhibitionssystem ausführlich beschrieben
Versuch D2: Phosphofructokinase, ein kooperatives Enzym (?) 20 :
Wie unter 7.1 gezeigt, wird PFK jenseits einer bestimmten ATP-Konzentration zum
allosterischen, d.h. positiv kooperativ arbeitenden Enzym. Dieser Effekt soll bei konstanter
ATP-Konzentration und steigender Gabe an F-6P nachvollzogen und später durch
Computer-Unterstützung mit Hilfe des Programms Composit ausgewertet werden.
Substanzen (außer jenen zu D1):
1a) Testmischung 50 mM Glycylglycin (K + -Salz, pH 7.1)
0.01% Albumin
14 mM Cystein
0.4 mM MgCl 2
Pipettierplan: steigende F-6P Konzentrationen
Testmisch.(1a) 2599 2598 2590 2588 2585 2580 2575 2545 2495 2445 2395
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NADH,H (5) 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150
F-6P (4) 1 2 5 7 10 15 20 50 100 150 200
- Warten: F-6P-Depletion -
ATP (2) 21 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150
20 J. V. Passonneau & O. H. Lowry (1962) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7, 10-15, Fig. 2; ATP: 2.3 mM;
F-6P: 0.1-3 mM. T. E. Mansour und C. E. Ahlfors (1968) J. Biol. Chem. 243, 2523-2533 Fig. 7; ATP: 1 mM; F-
6P: 0.1-20 mM in Testmischung 1a (Kooperativität bei pH 6.9 aber nicht bei pH 8.2).
21 Hier könnte es sinnvoll sein, mindestens mit jener ATP-Konzentration zu arbeiten, die im Pipettierplan zu
Versuch D1-A die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ergab. WARUM??

60
Km/Ki
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren der ATP-Lösung gestartet, und der Abfall der
E 340 wird registriert. Verwenden Sie Testmischung 1a und variieren Sie den pH-Wert (6.9-
7.1; Literaturvorgabe ist pH 6.9!!), die [ATP]-Basiskonzentration bzw. den [F-6P]-Konzentrationsbereich
(Messpunkte zwischen 1 und 20 µl an F-6P), falls das Phänomen sich mit
den Vorgaben nicht deutlich zeigt.
Vorschlag: Mit dem Pipettierplan kann aufgrund der zahlreichen kritischen Parameter nur
eine Anregung gegeben werden. Beginnen sie bei der höchsten F-6P-Konzentration, da hier
die Kinetik am wenigsten Probleme bereiten sollte. Dann F-6P Konzentration zunächst in
Zweierstufen senken, bis der problematische Bereich erreicht wird. Schließlich den
messbaren Bereich – insbesondere bei niedrigen F-6P Konzentrationen – so gut wie möglich
abdecken. Falls die Depletion zu lange dauert: Stammlösung anlegen und inkubieren, dann
vermessen und aliquotieren.
- können Sie das in Lehrbüchern häufig zitierte kooperative Verhalten der PFK
nachvollziehen?
- ergibt sich ein anderes Ergebnis, wenn Sie versuchen, Tangenten an den
wahren Ursprung (t = 0) anzulegen und dabei die "lag"-Phase bei Ihrer
Auswertung zu berücksichtigen?
Tangenten an diese Art Kinetik lassen sich im Prinzip (!) über Composit (Option
[S]ubstrat; [P]rogress curve) erzeugen, vergleiche auch Kapitel 9.2.2. Ein Beispiel-file
lässt sich über ṕrogkuŕ aufrufen
- diskutieren Sie Unterschiede, die aus beiden Tangentenverfahren (linearer Ast
bzw. Steigung der "lag"-Phase) resultieren und diskutieren Sie ggf. wie hier ein
kooperatives Phänomen zustande kommt.
Abb. 7.4 a: So weit kamen wir 2002 und 2004: im
unteren Konzentrationsbereich gibt es zu wenige
verlässliche Messpunkte, um eine Entscheidung
"kooperativ oder nicht" zu treffen.
Abb. 7.4 b: ...und so weit 2003: der untere
Konzentrationsbereich ist gut belegt und nur durch
kooperative Bindung zu erklären. Nahe der Sättigung
wären einige Messpunkte von Vorteil gewesen.
Angleichung in "Composit" (Adair) liefert:
Vmax = 7
K(1) = 1300
K(2) = 1.3.
7.5 Versuch D3: Pyruvatkinase, ein kooperatives Enzym (?):

61
Km/Ki
Carminatti et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 7284-7288; zur Zeit nicht durchgeführt!
Alle Gruppen, die nicht D1B oder D2 durchführen
Neben PFK ist die PK, ein K + /Mg ++ -abhängiges Tetramer, das zweite hauptsächliche regulatorische Enzym in der Glycolyse. Wie
die PFK spricht es auf die Energiebilanz der Zelle an und unterliegt einer typischen 'feed-forward' Aktivierung durch F-1.6BP (warum?).
Enzyme aus vielen Organismen binden ihr Substrat, PEP, in kooperativer Weise; für das Skelettmuskelenzym wurde dies nicht
beschrieben. Erste Hinweise dafür, dass dennoch ein allosterisches Protein vorliegt, ergaben sich über die Untersuchung eines relativ
spezifischen Inhibitors, Phenylalanin (vergl. Kap. 3.5).
Substanzen
1) Testmischung 0.1 M Tris x HCl, pH 7.8
0.1 M KCl
10 mM MgCl 2
2) 5 mM Phosphoenolpyruvat (PEP) in 1)
3) 50 mM ADP in 1)
4) 150 mM Phenylalanin (Phe) in 1)
5) 4.8 mM NADH,H +
6) Enzym Pyruvatkinase; Kristallsuspension etwa 1:10 verdünnt.
Geeignete Verdünnung in 1) ausprobieren und optimieren, so dass in Abwesenheit von Phe eine gut auswertbare Kinetik erhalten wird
7) Hilfsenzym Lactatdehydrogenase (LDH) als Kristallsuspension
Pipettierplan: steigende Phe Konzentrationen
Testmisch.(1) 2690 2685 2680 2670 2640 2540 2490 2440
Pyruvat Kinase (6) 5 5 5 5 5 5 5 5
Hilfsenzym (7)
je 5 µl LDH
Phe - 5 10 20 50 150 200 250
ADP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100
NADH,H + (5) 100 100 100 100 100 100 100 100
PEP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren von 100 µl an PEP gestartet und der Abfall der E 340 wird registriert. Tragen Sie die Phe-
Konzentration gegen die relative Hemmung (0 für die Reaktion ohne Phe; maximal 1 für die vollständig gehemmte Reaktion) auf und
behandeln Sie die erhaltene Kurve als Bindungskurve des Inhibitors.
Falls sich die Kooperativität nicht deutlich zeigt, bitte deren pH-Abhängigkeit berücksichtigen. Anhand Abb. 7.4 ist zu sehen, dass der
typische kooperative (sigmoide) Verlauf nur dann deutlich wird, wenn der Bereich niedriger [Phe] Konzentration hinreichend abgedeckt ist.
Ggf. weitere Verdünnungsschritte dazunehmen.
Abb. 7.4 (nach einem
Praktikumsprotokoll): Phenylalanin ist
kooperativ bindender Inhibitor der
tetrameren Muskel-Pyruvatkinase (PK).
Auftragung der sigmoiden
Sättigungskurve in Form eines 'Hill-Plot'
einen Hillkoeffizienten n H = 1.7. Dieser
Kooperativitätsparameter ähnelt dem
Hämoglobins, das als Prototyp eines
kooperativen Proteintetramers gilt.
ein
Die
ergibt
des
- aus dieser 'Bindungskurve'lassen sich mit Hilfe des Programms Composit 'K m -Werte' [K(1) und K(2)] ermitteln, die hier
allerdings als K i -Werte zu interpretieren sind;
- wie groß sind das Verhältnis K(1)/K(2) bzw. der Hill-Koeffizient, n H , für die Bindung von Phe an PK (Programme
Composit oder MMenten)?
8 BESTIMMUNG VON K m - UND K i -WERTEN

62
Km/Ki
8.1 Sättigungsphänomene: der ES-Komplex
http://de.wikipedia.org/wiki/Michaelis-Menten-Theorie
Die normalen Prinzipien chemischer Reaktionskinetik treffen naturgemäß auch auf enzymatisch
katalysierte Reaktionen zu, jedoch sind einige Besonderheiten zu beachten, die
A
B
[Substrat]
sich unter dem Begriff "Sättigungsphänomen" zusammenfassen lassen:
Abb. 8.1: Enzym-Substratkomplex (ES) und das Sättigungsphänomen
A - Sättigungsfunktion bei Behandlung eines Enzyms bei niedriger (1) und hoher (2) Substrat-mit
steigenden Substratkonzentrationen;
B - simplistische graphische Ermittlung der kinetischen Parameter K m und V max nach Michaelis und
Menten (1913). 22
Abb. 8.1A zeigt den Enzym-Substratkomplex bei niedriger (1) und hoher (2)
Substratkonzentration. Bei niedriger Substratkonzentration ist das Enzym von
wenigen Molekülen S umgeben und die Wahrscheinlichkeit, dass ein Molekül auf
das aktive Zentrum trifft ist geringer als bei hoher Substratkonzentration. Mit
steigender S-Konzentration wird die Zeit, die verstreicht bis ein neues Molekül S auf
eine freie Bindungsstelle trifft, immer kürzer, bis schließlich jede freiwerdende
Bindungsstelle sofort wieder besetzt werden kann. Unter dieser Bedingung ist das
22 Bitte, untersuchen Sie mit den Ihnen zur Verfügung stehenden Mitteln (Programme
Composit, KmVm, MMenten oder Enzfitter), ob Michaelis und Menten diese Hyperbel (die den
Messwerten der Abb. 4.1 entspricht) hinsichtlich der Parameter V max (3.7) und K m (0.015) korrekt
ausgewertet haben: die [S], v o -Werte für diese Graphik wurden unter "MICHAELI.HYP"
abgespeichert. Überprüfen Sie auch die entsprechenden Darstellungen in jedem beliebigen
Lehrbuch. Was lernen Sie über die Ablesbarkeit von K m und V max aus Sättigungskurven bzw. über die
Unfehlbarkeit berühmter Autoren?
Bitte beachten Sie anhand der Datei "MICHAELI.HYP" die Regeln, nach denen Dateien zur
Bearbeitung im Computer eingegeben werden müssen. Die obligatorische Reihenfolge lautet stets
kleinster X-Wert - erster Y-Wert;
zweiter (größerer) X-Wert - zweiter Y-Wert etc.
eine Eingabe des Wertes 0 - 0 ist nicht zulässig bzw. nötig. X-Werte sind typischerweise
Zeitpunkte oder Substratkonzentrationen und Y-Werte Extinktionswerte.

63
Km/Ki
Enzym "gesättigt", die Umsatzgeschwindigkeit hat ihr Maximum erreicht und hängt
nur noch von der Zahl der Enzymmoleküle (genauer: aktiven Zentren) sowie der
"turnover number" (d.h. der molaren Aktivität nach Kap. 4.10) ab.
In Abb. 8.1B sind diese Verhältnisse in einem Koordinatensystem dargestellt.
Bei niederen Konzentrationen an S ist die Anfangsgeschwindigkeit des enzymatischen
Umsatzes (v bzw. v o ) nahezu proportional der Substratkonzentration, d.h. die
Reaktion ist erster Ordnung bezogen auf das Substrat. Bei steigenden
Substratkonzentrationen steigt v zunächst unterproportional (gemischte Ordnung,
"mixed order") um dann in den Bereich der Sättigung überzugehen, in dem eine
Reaktion nullter Ordnung vorliegt. Alle Enzyme zeigen das Sättigungs-Phänomen,
unterscheiden sich jedoch dramatisch in der Substratkonzentration, bei der diese
erreicht ist. Diese Beobachtung führte A.J. Brown und V. Henri zur Hypothese, dass
Enzym und Substrat einen reversiblen Komplex ES ausbilden, der einen wesentlichen
Schritt der enzymatischen Katalyse darstellt (heute weiß man, dass in diesem
Komplex das Substrat in einen kurzlebigen Übergangszustand überführt, d.h.
aktiviert werden kann).
1913 entwickelten L. Michaelis und M. L. Menten eine in ihren Grundprinzipien
heute noch gültige Theorie; diese wurde später durch G.E. Briggs und J.B.S. Haldane
ausgedehnt und besser fundiert. Die Theorie ermöglicht die quantitative Analyse
vieler Aspekte der Enzymkinetik und -inhibition und liegt auch dem
Computerprogramm "MMenten" zugrunde, welches verschiedene graphische
Auswertungsverfahren auf dieser Basis illustriert.
8.2 Katalytische Effizienz: das k cat /K m -Kriterium
http://de.wikipedia.org/wiki/Fließgleichgewicht
Unter Berücksichtigung der Reversibilität wäre eine enzymatische Reaktion wie folgt
zu formulieren:
Bei enzymkinetischen Messungen werden "steady-state" Bedingungen (keine Änderung
von [ES]) dadurch angenähert, dass Messungen auf den Zeitpunkt t=0 ([S]=[S o ])
extrapoliert werden. Wie im "steady state" spielt hier die Rückwärtsreaktion (k -3 ) noch
keine Rolle. Da die chemische Umsetzung ES -> EP der langsamste (d.h.
geschwindigkeitsbestimmende) Schritt ist, wird k 3 gegenüber k 2 vernachlässigt, woraus die
allseits anzutreffende Beziehung

64
Km/Ki
resultiert.
Wenn Substratkonzentrationen den K m -Wert stark überschreiten, entspricht die
Reaktionsgeschwindigkeit (V max ) dem Produkt k 2 ×[E o ], da die Gesamtheit vorhandenen
Enzyms (E o ) als ES-Komplex vorliegt. Für den Fall, dass k 2 den limitierenden Schritt
kennzeichnet (und damit k cat = k 2 wird) wird diese Konstante zur "molaren Aktivität",
"Wechselzahl" oder "Turnover-Number" (Einheit: mole Substrat /(mol . Enzym Zeit).
Da die meisten Enzyme unter physiologischen Bedingungen nicht mit Substrat
gesättigt sind, wird nicht V max , sondern nur ein Wert v=k 2 ×[ES] erreicht. Damit stellt sich die
Frage nach einem sinnvollen Effizienzparameter. Unter der Voraussetzung, dass [S]

65
Km/Ki
Abb. 8.3: Zur Abschätzung von k cat /K m . Die Tangente an
den Urspung hat eine Steigung V max /K m . Wird V max
als molare Aktivität ausgedrückt (d.h. als V max /E o ),
so beträgt die Steigung k cat /K m .

66
Km/Ki
8.3 Ableitung der Michaelis-Menten Beziehung

67
Km/Ki
8.4 Nichtlinearen Regression: Angleichung der Michaelis-Menten-Beziehung
http://de.wikipedia.org/wiki/Regressionsanalyse
Regressionsanalysen sind Techniken, mit denen für eine Gleichung y = f(x) die Parameter
so angeglichen werden, dass minimale Abweichungen zwischen experimentellen und
kalkulierten Werten entstehen. Für diesen Fall wird die gewichtete Summe der
Fehlerquadrate (SSQ oder χ 2 genannt) minimiert. Zur Wichtung dient die Varianz (σ i ) des
Datenpunktes; je größer diese ausfällt, desto weniger trägt der betreffende Punkt zur
Analyse bei:
χ
2 i
=Σ∆ [ yi
/ σ ]
2
i
Die Regressionsanalyse ist die leistungsfähigste Methode zur Datenanalyse ist, setzt aber
voraus, dass nur y (Reaktionsgeschwindigkeit) und nicht x (Substratkonzentration) einem
Fehler unterliegt.
Lineare Regression lässt sich nur auf lineare oder linearisierbare Funktionen
anwenden. Die vertraute Lineweaver-Burke-Beziehung ist zwar eine algebraisch korrekte
Umformung der Michaelis-Menten Beziehung, ihre Anwendung liefert aber nur korrekte
Ergebnisse, wenn die Messwerte fehlerfrei sind. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass
sich die Realität nur mit einer erweiterten Michaelis-Menten Beziehung
V max[ Si
]
vi
= + ei
mit e i als Fehlerparameter, beschreiben Km + [ lässt. S ] ( 1
Diese )
Gleichung lässt sich nicht mehr
linearisieren, woraus sich die Forderung nach nichtlinearer Regressionsanalyse ergibt.
i
Nichtlineare Regression ermöglicht die Anpassung von Daten an jede Gleichung der
Form y = f(x). Da diese Gleichungen Kurven definieren, werden die Begriffe nichtlineare
Regression und ćurve fittinǵ zumeist synonym gebraucht. Bei nichtlinearen
Gesetzmäßigkeiten ergibt sich eine Komplikation dadurch, dass die zu optimierenden
Parameter nicht direkt ermittelt werden können: alle Kalkulationen gehen zwangsläufig von
Schätzwerten aus, so dass jede nichtlineare Regressionsanalyse ein iteratives Verfahren
darstellt. Ob diese Schätzwerte vernünftig waren, zeigt sich im nachhinein dadurch, dass
verschiedene Anfangsschätzungen zum gleichen Endergebnis führen. Das Verfahren geht
ursprünglich auf Gauss zurück. Unsere Programme arbeiten mit dem Algorithmus nach
Marquart, der sich bei größerer Abweichung der Schätzwerte als toleranter erweist.
Standard-Regressionsanalysen setzen voraus, dass Fehler einer Normalverteilung folgen. Ausreißer lassen
sich aufgrund des Algorithmus von Mosteller und Tukey (1977) unterdrücken. Dies wird durch Anwendung
eines weiteren Wichtungsfaktors (1 für Punkte geringer Abweichung, 0 für extreme Ausreißer) erreicht und
als "bisquare weighting" bezeichnet.
v i
8.5 Linearisierung der Michaelis-Menten Beziehung

68
Km/Ki
1)
V max × [ S]
v =
Km + [ S]
8.5.1 Lineweaver und Burk (doppelt reziproke Auftragung)
Bildung des Kehrwertes von (1) und Trennung des Bruchs auf der rechten Seite ergibt
2)
1 Km 1
= +
v V max S V
y = m × x + b
1
max
________________________________
1
[ S]
= 0:
1 v
= 1 V max ;
1 0 1 1 V max
:
1 1
v
=
[ S] = − ;
V max Km [ S]
= −
Km
8.5.2 Eadie-Hofstee (oben) und Scatchard Auftragung (unten)
Multiplikation beider Seiten von (1) mit dem Nenner liefert
3) vS [ ] + vKm=
Vmax[ S]
Division beider Seiten von (3) durch Km[S]:
4)
5)
v +
Km
v
[ S ] = max VKm
v 1 =−
[ S]
Km v max
+
VKm
y = m × x + b
______________________________________
v
[ S ]
= 0: v = V max
v = 0:
v V max
[ S ]
=
Km

69
Km/Ki
8.6 Parametervergleich: Bindungsmessungen und Enzymkinetik
8.7
Messung im thermodynamischen kinetische Messung
Gleichgewicht (Bindungsmessung) (Enzymkinetik)
r, Zahl besetzter Bindungsplätze v, Umsatzgeschwindigkeit
n, Zahl vorhandener Bindungsplätze V max , maximale Umsatzgeschwindigkeit
K d , Dissoziationskonstante [mol/l] K m , Michaeliskonstante [mol/l]
L, Konzentration an freiem Liganden S, Substratkonzentration
Mit diesen Konversionen lassen sich alle Gleichungen/Auftragungen der
Enzymkinetik für Protein Ligandenwechselwirkungen einsetzen und vice versa.
8.7 Zur Auswertung emzymkinetischer Daten: Merkmale verschiedener Plots
Hans Bisswanger, "Theorie und Methoden der Enzymkinetik", Verlag Chemie (1979
8.7.1 Computergestützte Analyse
Die Bestimmung der Parameter K m (K d ) und V max (n) aus hyperbolischen Sättigungsfunktionen
erfolgt heute zweckmäßigerweise mit Computerunterstützung, d.h. durch
nichtlineare Regressionsanalyse. Eine einfache Analyse dieses Typs findet sich in
den Programmen "KmVm" und "MMenten"; sich überlagernde Hyperbeln können
durch das höherentwickelte Programm "Composit" analysiert werden.
8.7.2 Bedeutung konventioneller Auftragungen
Zur Datenrepräsentation und für eine vorläufige graphische Analyse eignen sich
lineare Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung, wie sie unter 8.4
abgeleitet wurden. Aufgrund unvermeidbarer Messfehler beinhalten alle diese
graphischen Verfahren bei der Auswertung einiges an Subjektivität, was man sich
am besten mit Hilfe der Graphikprogramme "Enzpack" oder "MMenten" 23
veranschaulicht. Dort und bei Inspektion der Abbildung 8.6-a wird man folgendes
feststellen:
23 Abbildung 8.4 (umseitig): Möglichkeiten der Datentransformation und Datenausgabe im
Programm "MMenten". Das Diagramm "V vs. S plot" zeigt die Messdaten (bei gleichbleibenden
Konzentrationsunterschieden auf der S-Achse); die weiteren Diagramme zeigen Transformationen für
diese Messpunkte, wie sie z.B. unter 'files' im Programmpaket beschrieben werden.

70
Km/Ki

71
Km/Ki
Lineweaver-Burk Diagramm (doppelt-reziproke Auftragung)- zur Datenrepräsentation meist
verwendet, zur Auswertung jedoch am wenigsten verlässlich. Kleine Fehler in v ergeben bei kleinen
S-Werten eine große Abweichung in 1/v, bei großen S-Werten ist diese eher zu vernachlässigen. Die
Autoren der Methode haben die Unsicherheit großer 1/v Werte betont und darauf hingewiesen, dass
diese grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender haben dies zumeist ignoriert. Wo
möglich sollte dieses Verfahren zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden,
vorzugsweise durch das
Hanes(-Wilkinson) Diagramm (Hanes-Woolf Diagramm)- Bestmögliche Auftragung dieses Typs.
Fehler in [S]/v sind eine weit bessere Annäherung der Fehler in v. Aufgrund einer unverfälschten
Spreizung der Messpunkte entlang der S-Achse wird das Ergebnis durch einzelne Ausreißer
prinzipiell weniger verfälscht. Nur bei dieser Auftragung kann auch eine Datenoptimierung durch
lineare Regression sinnvoll sein. K m ist direkt ablesbar.
Eadie-Hofstee Diagramm- Verdient eine Mittelstellung. Der Fehler wächst mit v/[S]. Da v bei beiden
Koordinaten eingeht, konvergieren alle Abweichungen zum Ursprung.
Scatchard-Diagramm- gleicht dem vorigen (Achsen sind vertauscht) und wird zumeist zur
Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle kinetischer Daten) angewendet. Scatchard- und
Eadie-Hofstee Diagramme gelten als beste Werkzeuge zur Diagnose kooperativer Phänomene. Im
Falle negativer Kooperativität oder nicht-identischer, isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver
Verlauf mit linearem Endast (Abb. 8.6.2). Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten (K d bzw
K m ) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze (aktiven Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der x-
Achse abzulesen
Hill-Diagramm- klassische Methode für die Bestimmung der Kooperativität eines Proteins (Enzyms).
Die Graphik setzt Kenntnis von V max (bzw. n) voraus. Die Auftragung von log [S] vs. log v/(V max -v)
bzw. log [L] vs log r/(n-r) ist eine Gerade der Steigung 1 (n H =1), wenn die Bindungsplätze
voneinander unabhängig sind. Bei kooperativen Systemen kann die Steigung am Nullpunkt (der “Hill-
Koeffizient”) theoretisch der Zahl der Untereinheiten (n) gleichen, wird aber praktisch darunter
bleiben. Falls die individuellen K m (K d ) Werte nicht durch Tangenten an die 45 o Enden der Kurve
extrapolierbar sind, ist n H als Maß der Kooperativität einzusetzen; nur für n H =1 ist der Nulldurchgang
gleich ln K m (bzw. K d ). Für Hämoglobin (n = 4), das als klassisches, hochkooperatives Protein gilt,
wurde n H zu 2.8 bestimmt. Messdaten können von den Programmen "MMenten" und "Composit" aus
abgerufen bzw. demonstriert werden (Datenfiles "EX2 bis EX5).
Abb. 8.5: Übersicht der gebräuchlichsten Diagramme zur Darstellung enzymkinetischer Daten. Es
sind jeweils 10 Messwerte mit gleichbleibenden Differenzen hinsichtlich der Substratkonzentration
und den Grenzen für den konstanten absoluten Fehler eingezeichnet. Diese erfahrungsgemäß
realistische Annahme impliziert einen mit abnehmender Genauigkeit (Substratkonzentration)
zunehmenden relativen Fehler. Ferner ist angegeben, wie die Konstanten abzulesen sind. Alle
Kalkulationen und die meisten Graphiken können mit den Computerprogrammen "MMenten" bzw.
"Enzpack" nachvollzogen werden. Die in mancher Hinsicht überlegene direkt-lineare Auftragung
wird unter 8.7 beschrieben.

72
Km/Ki
8.7.3 Allosterie und Kooperativität
nach P. Karlson, "Kurzes Lehrbuch der Biochemie"
http://de.wikipedia.org/wiki/Allosterie
http://de.wikipedia.org/wiki/Kooperativität
Die Veränderung der Bindungsaffinität eines Proteins zu kleinen Molekülen (beim
Hämoglobin: des Sauerstoffmoleküls) durch Beeinflussung der Raumstruktur
bezeichnet man auch als allosterische Regulation oder kurz als Allosterie.
Allosterische Effekte spielen auch eine bedeutende Rolle bei der Regulation der
Enzymaktivität.
Der Begriff „Allosterie“ wird in der Literatur unterschiedlich gebraucht. Er
wurde für Enzyme benutzt, die bestimmte Effektoren an anderer Stelle binden als
das Substrat; (daher rührt der Name allos = anders, steros = Ort), und bedeutete
zunächst die Veränderung der Raumstruktur unter Beeinflussung des aktiven
Zentrums des Enzyms. Manche Autoren meinen, dass für den allosterischen Effekt
auf jeden Fall eine kooperative Wechselwirkung zwischen Untereinheiten notwendig
ist; danach dürften bei monomeren Proteinen keine allosterischen Effekte auftreten.
Indessen kennt man auch bei solchen Proteinen Veränderungen der Tertiärstruktur
durch kleine Moleküle, die einen Einfluss auf das aktive Zentrum haben können. Es
hat sich daher eingebürgert, auch diese Änderungen der Raumstruktur unter den
Begriff der Allosterie zu subsummieren. Nehmen Sie das Beispiel der
Phosphofructokinase: jede Polypeptidkette ist hier als Fusion zweier Untereinheiten
(C und R) zu sehen. Jede dieser Untereinheiten bindet ATP, C in seiner Eigenschaft
als Substrat (Coenzym) und R in seiner Eigenschaft als allosterischer Inhibitor.
Abb. 8.6.1: Schematische Darstellung (positiver) Kooperativität am Beispiel der
Hämoglobinuntereinheiten während der Sauerstoff-aufnahme. Die ovalen Formen entsprechen der
Konformation mit niedriger Affinität, die eckigen Formen der Konformation mit hoher Affinität. Die
beiden ersten Os-Moleküle werden vermutlich an die «-Ketten gebunden; alsdann erfolgt eine
Konformationsänderung, bei der alle vier Untereinheiten in die Konformation mit hoher Affinität
übergehen, und die beiden letzten Sauenstoffe werden in rascher Folge aufgenommen. Dadurch
erklärt sich die große Steilheit der Sauerstoffbindungskurve im mittleren Abschnitt.
8.7.3.1 Definition und Darstellung kooperativer Bindungsphänomene

73
Km/Ki
1 Man unterscheidet
- Enzyme vom Michaelis-Menten Typ (2)
- kooperativ arbeitende Enzyme (3.1 und 3.2)
2 Michaelis-Menten Enzyme ergeben eine hyperbolische Sättigungsfunktion, die
mit Hilfe der gängigen Linearisierungsverfahren hinsichtlich K m und V max
analysiert werden kann.
- im Hill-Diagramm resultiert eine Gerade mit 45 Grad Steigung (n H = 1); die
Abszisse wird bei K m geschnitten
- die Gruppe umfaßt monomere Enzyme und oligomere Enzyme mit
unabhängig operierenden Untereinheiten (Beispiel: LDH).
3 Kooperativ arbeitende Enzyme ergeben keine Geraden in den gängigen
Linearisierungsverfahren (die hyperbolisches Verhalten voraussetzen)
3.1 Enzyme mit positiver Kooperativität ("sigmoides Verhalten") lassen sich durch
zwei K m -Werte und einen V max -Wert charakterisieren.
- Es gilt: K m (1) > K m (2)
- im Hill-Diagramm resultiert eine Funktion, deren Steigung am Abszissenschnittpunkt
>45 o ist (n H >1); die Verlängerung ihrer terminalen 45 Grad-Äste
gibt Abszissenschnittpunkte bei K m (2) bzw. K m (1)
3.2 Enzyme mit negativer Kooperativität ("pseudohyperboles Verhalten") lassen
sich gleichfalls durch zwei K m -Werte und einen V max -Wert charakterisieren.
- Es gilt: K m (1) < K m (2)
- im Hill-Diagramm resultiert eine Funktion, deren Steigung am Abszissenschnittpunkt

74
Km/Ki
Abb. 8.6.2: Drei grundsätzlich verschiedene Sättigungsfunktionen (A, B, C), Versuche zu ihrer
Angleichung (zweite und dritte Zeilen) und zu ihrer Linearisierung (vierte und fünfte Zeile). Nur die
Hyperbel (A) lässt sich linearisieren. Die Funktionen A (Summe zweier identischer Hyperbeln) und C
(Summe zweier unterschiedlicher Hyperbeln), nicht aber die Funktion B erlauben eine Angleichung
über die Option ́double hyperbolić. A repräsentiert ein Michaelis-Menten Enzym, die Funktionen B
und C entstehen u.a. durch Kooperativitätsphänomene, C auch aufgrund der parallelen Arbeit von
Isoenzymen.

75
Km/Ki
8.8 Soforttest für Messwerte: die direkt-lineare Auftragung
R. Eisenthal und A. Cornish-Bowden (1974) Biochem. J. 139, 715-720
A. Cornish-Bowden und R. Eisenthal (1974) Biochem. J. 139, 721-730
F. de Miguel Merino (1974) Biochem J. 143, 93-95
A. Cornish-Bowden (1975) 149, 305-312
A. C. Storer, M. G. Darlison und A. Cornish-Bowden (1975) Biochem. J. 151, 361-367
M. Markus, B. Hess, J. H. Ottaway und A. Cornish-Bowden (1976) FEBS Lett. 63, 225-230
A. Cornish-Bowden und R. Eisenthal (1978), Biochim. Biophys. Acta 523 268-272
http://de.wikipedia.org/wiki/Enzymkinetik
Für die Ermittlung von K m -Werten bzw. Inhibitionsmustern ist es essentiell, jede
gemessene Anfangssteigung sofort (!!!) auf ihr Zutreffen zu überprüfen. Als Vortest
kann das Einzeichnen in ein v vs. S-Diagramm uneingeschränkt empfohlen werden.
Die S-Werte sind vor Versuchsbeginn bekannt (eingestellte Substratkonzentrationen!),
während der Versuchsreihe ist dann nur der Ordinatenwert für v (bzw. die
Anfangssteigung in beliebigen Einheiten) nachzutragen. Im Gegensatz zu normalen
Auftragungen werden die Messwerte also nicht als Punkte dargestellt, sondern in
Form von Linien, die sich im günstigsten Fall in einem gemeinsamen Punkt
schneiden. Der Demonstration im Programm "Enzpack" (Option E) können Sie entnehmen,
dass sich dies aus der Geometrie
der klassischen Hyperbel ergibt.
Abb. 8.7: Beziehungen zwischen einer Hyperbel und
ihren Asymptoten.
For a rectangular hyperbola through the origin, given by
v=V max . [S]/K m +[S], the asymptotes are [S]=-K m and v=V max ,
and they intersect at the point (-K m , Vmax) in the second
quadrant. Any line through this point intersects at the [S] and
v axes at points [S i ], 0 and 0, v i that correspond to a point
([S i ], v i ) on the hyperbola.' Darstellung nach F. de Miguel
Merino; nach Cornish-Bowden befindet sich die Hyperbel im
zweiten, die Schnittpunkte im ersten Quadranten.
Im direkt-linearen Plot wird die Fehlerbehandlung
weitgehend vereinfacht: die Linien im zweiten
Quadranten werden mehr oder weniger um einen
Punkt
streuen. Mittelwertsbildung gibt dann die
wahrscheinlichen Werte für die Parameter K m und
V max . Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte
(nicht identisch mit deren Standardabweichung!)
können Ausreißer leicht identifiziert und sog. "medians" 24 abgelesen werden; dies erledigen auch die
Programme "Enzpack" und MMenten".
24 'median': derjenige Messpunkt, zu dessen rechter bzw. linker Seite sich die gleiche Anzahl
weiterer Messpunkte befindet. 'Medians' statt 'means' (Mittelwerten) sind stets zu bevorzugen, wenn
die Fehlerverteilung unsymmetrisch ist; 'Ausreißer' beeinflussen das Ergebnis dann nicht. Existiert
eine gerade Zahl an Messpunkten (bzw. Schnittpunkten im direkt-linearen Diagramm), so gibt es
zwangsläufig zwei 'medians'.

76
Km/Ki
.9 Enzymhemmungen
in Anlehnung an: Klaus Dose, "Biochemie - eine Einführung", C Springer-Verlag (1980), S. 87 f.
Wiedergabe der Abbildungen mit freundlicher Genehmigung des Verlages. Neuauflagen 1991, 1996
Ergänzt durch Gerhard Michal, Biochemical Pathways (1999);
http://de.wikipedia.com/Enzymhemmung
Der Einfluss eines Inhibitors I auf den K m- bzw V max -Wert einer enzymkatalysierten
Reaktion kann zur Charakterisierung des Hemmtyps herangezogen werden.
Alternativ kann das Verhältnis des K i -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes
EI) und des K is -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EIS) zur
Klassifizierung dienen
Abb. 8.8 Inhibitionstypen.
A - Ḿixed-typé. Der Inhibitor bindet sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym-
Substratkomplex. K m und V max werden nicht erreicht. Im Sonderfall des nichtkompetitiven Inhibitors
wäre K i =K is. K m bliebe unverändert, aber V max würde nicht erreicht.
B - Kompetitiv. Der Inhibitor bindet anstelle des Substrats. K m kann nicht erreicht werden während
V max mit steigendem Substratüberschuss angenähert wird. K is hat keine Bedeutung, d.h. ist
unrealistisch groß.
C - Unkompetitiv. Der Inhibitor assoziiert nur, nachdem das Substrat bereits gebunden ist. V max kann
nicht erreicht werden, währende der K m -Wert scheinbar sinkt (!). K i hat keine Bedeutung, d.h. ist
unrealistisch groß.
Reversible Hemmtypen werden häufig als kompetitiv, Mischtyp (ḿixed typé;
Sonderfall: nichtkompetitiv) und unkompetitiv klassifiziert. Obgleich diese Typen
häufig auf der Grundlage von Einsubstratenzymen definiert werden, sind sie - mit
Ausnahme der kompetitiven Hemmung - nur für Mehrsubstratenzyme von
Bedeutung.

77
Km/Ki
8.9.1 Die kompetitive Hemmung
Neben der Substratüberschuss-Hemmung ist dies der gängigste Hemmtyp. Er
begegnet uns in Form der Produkt-Hemmung (Hemmung der "Hinreaktion" durch
das Reaktionsprodukt, welches zwangsläufig in Kompetition zum Substrat steht)
sowie bei Substratanalogen. Substratanaloge wie das α-Ketobutyrat (8.10.2) können
von einem Enzym (H 4 -Form der LDH) noch die Stelle eines Substrates einnehmen,
während sie für ein Isoenzym (M 4 -Form der LDH) fast schon die Qualität eines
kompetitiven Inhibitors haben. Um beim Beispiel der LDH zu bleiben: für beide
Substrate, Pyruvat (Brenztraubensäure, "pyruvic acid") und NAD + gibt es strikte
kompetitive Inhibitoren, nämlich Oxamat ("Oxamidsäure") bzw. Salicylat. ADP nimmt
den Adenosinteil des Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD + -)
Bindungsplatzes ein (Abb. 2.1). Einige strukturellen Ähnlichkeiten sind im
folgenden hervorgehoben:
Pyruvat Oxamat NAD + Salicylat
(Nicotinamidteil)
Substratanaloge Verbindungen können zur vorübergehenden (reversiblen)
Hemmung von Enzymaktivitäten therapeutische Bedeutung haben. Beispiele sind
Analoge des Acetylcholins zur Hemmung der lytischen Aktivität der Acetylcholinesterase,
um vorübergehend höhere Konzentrationen des Neurotransmitters
aufrechtzuerhalten.
Eine rein kompetitive Hemmung zeichnet sich dadurch aus, dass der Vorgang
für den die Inhibitionskonstante
K i =
[E][I]
[EI]
das Gleichgewicht bestimmt, mit der eigentlichen Reaktion
E + S _ >
ES
_ >
E+P
konkurriert. Bei sehr großem Substratüberschuss kann somit das Substrat den

78
Km/Ki
Inhibitor faktisch verdrängen (was graphisch durch Extrapolation auf S -> 4 bzw 1/S-
>0 erzielt wird) während bei mittleren Substratkonzentrationen ein verlangsamter
Substratumsatz erfolgt.
Von diagnostischem Wert für diesen Inhibitionstyp in seiner reinen Form sind
somit die Tatsachen, dass
- V max durch einen kompetitiven Inhibitor nicht beeinflusst wird, während
- der K m -Wert scheinbar vergrößert wird (weshalb man hier zweckmäßig
auch vom K m '-Wert spricht). Diese scheinbare Affinitätsveringerung ist
eine Funktion der Inhibitorkonzentration und des K i -Wertes
Dieser Sachverhalt wird fast durchweg durch das Lineweaver-Burk-Diagramm
dargestellt. Eine lohnende Übung besteht darin, den gleichen Kompetitionstyp mit
Hilfe der anderen unter 8.6 beschriebenen graphischen Verfahren zu
charakterisieren - eine Fähigkeit, die dem
Programm "MMenten" mitgegeben wurde.
Abb. 8.9: Kompetitiver Inhibitionstyp, dargestellt
nach Lineweaver-Burk. Beachte den konstanten
1/V max Wert (infolge eines unveränderten V max ) und
den von der Inhibitor- konzentration abhängigen
Wert für -1/K m ' (infolge einer scheinbar
verminderten Affinität)
8.9.2 Die allosterische Hemmung
Bei diesem Hemmtyp wird der Inhibitor (auch negativer Effektor/Regulator/Modulator
genannt) im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung abseits vom aktiven Zentrum
des Enzyms gebunden. Dabei kann eine Konformationsänderung ausgelöst werden,
bei der Effektor- und Substrat-Bindungsplatz (d.h. aktives Zentrum) miteinander
kommunizieren. Bei diesem Vorgang kann die Funktionsfähigkeit des aktiven
Zentrums sinken (Erhöhung von K m ) oder die Zahl der aktiven Zentren erniedrigt
werden (Erniedrigung von V max ). Ein klassisches Beispiel dieses Hemmtyps ist die
sog. "feedback"-Inhibition, d.h. die Drosselung des ersten (oder eines frühen)
Enzyms eines Stoffwechselweges durch dessen Endprodukt welches dann als
negativer Effektor (nicht: Substrat) auf das erste Enzym einwirkt. Zur Vertiefung:
siehe Kapitel 7.

79
Km/Ki
Die allosterische Hemmung wird häufig mit der nichtkompetitiven Hemmung gleichgesetzt – eine
Vereinfachung, die selten gerechtfertigt ist. Als Sonderfall der allosterischen Hemmung ist die
"negative Kooperativität" anzusehen. Sie wird bei oligomeren, aus gleichen Untereinheiten
bestehenden Enzymen beobachtet, bei denen sich die Substratbindungsplätze gegenseitig
behindern. Erstes Beispiel (1970) hierfür war die mit sinkender Affinität erfolgende Bindung von NAD +
durch die tetramere GAPDH. cf. Conway und Koshland, Biochemistry 7, 4011 (1968).
Zu allen allosterischen Hemmphänomenen gibt es die komplementären
Aktivierungsmechanismen:
negativer Effektor - positiver Effektor
Inhibitor - Aktivator
"feedback" Inhibition - "feed-forward" Aktivierung
negative Kooperativität - positive Kooperativität
(= Antikooperativität)
Klassisches Beispiel einer positiven Kooperativität (d.h. mit steigender Affinität
erfolgender Bindung) ist die Assoziation von O 2 oder CO 2 mit Hämoglobin, einem
Carrierprotein. Inzwischen gibt es zahlreiche weitere Beispiele aus dem Bereich der
Hormonrezeptoren und Enzyme (vergleiche PFK in Kapitel 7.1).
Allosterische Inhibitoren gehören grundsätzlich dem ḿixed typé an. Ist K i
(relativ zu K is ) sehr groß, so spricht man auch vom "unkompetitiven" Typ. Wäre
K i =K is (was unwahrscheinlich ist), so läge der Fall eines nichtkompetitiven Inhibitors
vor
Abb. 8.10: Allosterische Beeinflussung der Substrat
(S) Bindung durch einen Modulator (M) infolge einer
(allosterischen) Konformationsänderung.
8.9.3 Die "nicht-kompetitive" (allgemeiner: " mixed-type" Hemmung)
Leider wird dieser Hemmtyp zumeist mit der allosterischen Hemmung verwechselt.
Er wäre jedoch nur im Grenzfall mit diesem Hemmtyp identisch, nämlich dann, wenn
Bindung des Modulators (M) den Substratumsatz (nicht notwendigerweise die
Substratbindung) in irreversibler Art und Weise ausschließen würde. Die Literatur
liefert hierfür nicht ein einziges sauberes Beispiel, obgleich der Einfluss von Phe auf
Pyruvatkinase dem nahekommen soll.
Gekoppelt mit dem Begriff des nicht-kompetitiven Inhibitors ist das Postulat,
dass V max auch bei beliebigem Substratüberschuss nicht erreicht werden kann. K m
bliebe jedoch identisch, da eine Coexistenz von inhibierten (d.h. enzymkinetisch
nicht sichtbaren) und nicht inhibierten (d.h. normalen) Enzymmolekülen vorliegt.
Originellerweise werden diese Kriterien gerade durch "Enzymgifte" erfüllt, die eine
zum aktiven Zentrum gehörende katalytische Aminosäureseitenkette blockieren

80
Km/Ki
(vergl. Kap. 9). Diese genügen jedoch nicht der bei der ursprünglichen Formulierung
dieses Hemmtyps geforderten Reversibilität des Hemmvorganges.
Strikt genommen kommen einem "mixed-type" Inhibitor zwei Inhibitionskonstanten zu. Konstante K i
gilt für seine Bindung an das nackte Enzym, K is für die Bindung an den Enzym-Substratkomplex. Die
allgemeine, aus der Michaelis-Menten Beziehung abgeleitete Inhibitionsgleichung
v = __________V max × [S]____________
K m (1 + [I]/K i ) + [S](1 + [I]/K is )
gilt für "mixed-type" Inhibitoren in der gezeigten, vollständigen Form, für nichtkompetitive Inhibitoren
ist sie erfüllt, wenn Ki = Kis (d.h. in einem kaum zutreffenden Sonderfall, dem in Lehrbüchern
ungebührender Raum gegeben wird). Im Falle eines kompetitiven Inhibitors vereinfacht sich die
Gleichung durch Fortfall des Terms 1+[I]/K is und im Falle des unkompetitiven Inhibitors durch Fortfall
von 1+[I]/K i . Ein hervorragendes Kriterium für die Beurteilung des Inhibitionstyps liefert das Programm
"Composit", Option "[I]nhibition/[R]eversibel", bei dem K is im kompetitiven Fall gegenüber K i
außerordentlich große Werte annimmt (somit den Term [I]/K is gegen Null gehen läßt). Im Vorgriff auf
Kapitel 8.8.4 ist anzumerken, dass dort durch große K i -Werte der Term [I]/K i gegen Null ginge.
Als klassisches Kriterium des Hemmtyps ist nachfolgend wieder das Lineweaver-
Burk Diagramm angeführt:
Abb. 8.11: sog. "nicht-kompetitive" Hemmung,
dargestellt im Lineweaver-Burk Diagramm
8.9.4 Die "un-kompetitive" Hemmung
Neben der kompetitiven und der nicht-kompetitiven Hemmung gibt es noch einen
dritten einfachen Hemmtyp, die unkompetitive Hemmung, welche bei Einsubstrat-
Enzymen selten, bei Mehrsubstratenzymen häufiger auftritt.
Ein Inhibitor, der nur an den Enzym-Substrat-Komplex und nicht an das freie
Enzym bindet, wird als "unkompetitiv" bezeichnet. Die Reihenfolge der Bindung ist
festgelegt ("obligatory-order"), d.h. I kann nur nach S binden. Folgendes Schema
zeigt diesen Sachverhalt mit k 1 , k -1 , k 2 , Geschwindigkeitskonstanten und K is ,
Dissoziationskonstante des ESI-Komplexes:

81
Km/Ki
Demnach wird der Inhibitor V max (k 2 ) erniedrigen, denn ein Teil des Enzym-Substrat
Komplexes wird ständig in Richtung des inaktiven Komplexes ESI gelenkt. Ferner
wird die Geschwindigkeitskonstante k 1 durch Anwesenheit des unkompetitiven
Inhibitors I erhöht, da für die Wandlung des ES-Komplexes ein alternativer Weg (zu
ESI) eröffnet wird. Da k 1 Bestandteil der Dissoziationskonstanten des ES-Komplexes
(K d =k- 1 /k 1 ) bzw. seines K m Wertes ((k- 1 +k 2 )/k 1 ) ist, wird somit der K m -Wert scheinbar
erniedrigt, die Affinität des Substrates zum Enzym scheinbar erhöht. Im Lineweaver-
Burk Diagramm sind sowohl 1/V max als auch -1/K m gegenüber der nichtinhibierten
Reaktion mit (1+[I]/K is ) zu multiplizieren, so dass sich Parallelen ergeben (siehe
Abbildung). 25 . Zusammengefasst: Im Gegensatz zum nichtkompetitiven Inhibitor
erfolgt die Assoziation eines unkompetitiven Inhibitors nicht unabhängig vom
Substrat. Die Substrat-abhängige Bildung des ESI-Komplexes bedingt eine
scheinbare Erniedrigung von K m und
V max .
Abb. 8.12: Unkompetitiver Hemmtyp,
dargestellt im Lineweaver-Burk Diagramm
25 dies ergibt sich aus der Tatsache, dass hier die wie folgt modifizierte Inhibitionsgleichung anzusetzen ist:
v = __V max × [S]______
K m + [S](1 + [I]/K is )
die in der Umformung nach Lineweaver-Burk wie folgt lautet:
1 = K m . 1 + 1+I/K is
v V max S V max
Damit ergibt sich für 1/S = 0 das 'y-intercept' zu 1/v = (1+I/K is )/V max und für 1/v = 0 das 'x-intercept' zu
1/S = - (1+I/K is )/K m

82
Km/Ki
8.9.5 Nomenklaturvorschläge und Definitionen zum Gebiet der Enzymhemmung
und -regulation 26
1) Inhibitoren vom K m-Typ (klassische kompetitive Inhibitoren)
1.1 Besetzen Substrat-Bindungsplatz,
1.2 sind Substratanaloge (Reaktionsprodukte, transition-state Analoge, o.ä.),
1.3 senken scheinbar die Affinität für das Substrat (K m steigt),
1.4 V max wird bei Substratüberschuss erreicht.
2) Inhibitoren vom V max-Typ (klassische nichtkompetitive Inhibitoren und Enzymgifte)
2.1 Binden allosterisch (nichtkomp. Inh.) oder
2.2 binden irreversibel an Substratbindungsplatz (Enzymgifte)
2.3 in keinem Fall wird V max bei Substratüberschuss erreicht
2.4 sind keine Substratanaloge (Ausnahme: Affinitätsmarkierung!)
3) Allosterische Effektoren (K m - oder V max -Typ)
3.1 Besetzen allosterischen Bindungsplatz (vergleichbar 2.1),
3.2 erfüllen nicht unbedingt Kriterium 2.3, d.h.:
3.3 Effektorbindung beeinflusst Substratbindung, aber nicht umgekehrt: V-Typ (enzymkinetisch
nicht unterscheidbar von 2)), bzw.
3.4 Effektorbindung beeinflusst Substratbindung und umgekehrt: K m -Typ (enzymkinetisch
nicht unterscheidbar, jedoch mechanistisch verschieden von 1)).
3.5 Neben Inhibitoren umfaßt diese Gruppe auch Aktivatoren
8.9.6 Bestimmung von K i und K is aus sekundären Plots
Als diagnostisches Werkzeug zur Beschreibung von Inhibitionstypen kommt dem
Lineweaver-Burk Diagramm nach wie vor die größte Bedeutung zu. Zur Ermittlung
von K i -Werten erscheint seine direkte Anwendung umständlich, da K i aus einer
Reihe von Achsenabschnitten gemittelt werden muss. Eine klassische Lösung dieses
Problems besteht in der Anfertigung sekundärer 'plots', in denen
- die Steigungen der Geraden aus dem Lineweaver-Burk Diagramm (Ordinate) als
Funktion der jeweiligen Inhibitorkonzentration (Abszisse) aufgetragen werden. Der
neue Abszissenschnittpunkt ergibt dann direkt K i (nicht durchführbar im Falle eines
unkompetitiven Inhibitors, bei dem nur K is realisiert ist).
- die 'intercepts' (d.h. die Lineweaver-Ordinatenabschnitte = neue Ordinatenwerte) als
Funktion der jeweiligen Inhibitorkonzentrationen (Abszisse) aufgetragen werden.
Diese Auftragung, möglich im Falle des "mixed-type", des nichtkompetitiven und des
unkompetitiven Inhibitors, erlaubt am Abszissenschnittpunkt die Ablesung des K is
Wertes. 27
Derartigen sekundären "plots" sollten, wenn möglich, "bereinigte" Lineweaver-Burk
Diagramme zugrunde liegen. Zur Herstellung dieser Diagramme verwendet man die
nach einem verlässlicheren Verfahren (direkt-linearer "plot" oder computergestützte
nichlineare Regression) ermittelten Werte für K m und V max . Der gesamte Vorgang
kann mit Hilfe des Programmes "MMenten" (Optionen [I]nhibition, [R]eversible)
demonstriert bzw. ausgeführt werden.
26 Diese Aufstellung unterscheidet nur in V max - und K m -Typ, umfasst daher nicht die sog. 'mixed-type'
und 'unkompetitiven Inhibitoren', die beides beeinflussen.
27 Abb. 8.11: Inhibitionsmuster und deren Analyse in sekundären ṕlotś (die zwei nächsten Seiten)

83
Km/Ki

84
Km/Ki

85
Km/Ki
9.7 Dixon-Auftragung zur direkten Ablesung von K i -Werten
Literatur: M. Dixon und E.C. Webb "Enzymes", Academic Press 1964, pp 328
Der nachfolgend vorgestellte "Dixon-Plot" erlaubt eine graphische Mittelwertsbildung
von Schnittpunkten aus verschiedenen Messreihen; K i ist durch den
mittleren Abszissenwert dieser Punkte definiert während Kis auf diesem
Wege grundsätzlich nicht ermittelt werden kann. 28
Man bestimmt die Geschwindigkeit bei verschiedenen Substrat- und Inhibitorkonzentrationen.
Im Diagramm von 1/v vs. I erhält man dann Geraden, die sich
bei - K i schneiden (Abb. a) und b)).
Falls ein V max -Wert für die Reaktion bereits bestimmt wurde, ist es im kompetitiven Fall nur nötig,
Messungen bei einer Substratkonzentration durchzuführen, denn der Punkt, der K i definiert liegt dann
auf der Höhe 1/V max (Abb. c).
Abb. 8.12: Graphische Bestimmung von Inhibitionskonstanten nach Dixon ("Dixon Plot")
Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass Dixon später einen erweiterten Plot entwickelt hat, der
einige fragliche Annahmen eliminiert (Biochem. J. 129, 197, 1972): "The principle of Dixon (1965) has
been extended to give rapid graphical methods for determining ... K m and K i . It does away with the sometimes
questionable assumption that the amounts of substrate or inhibitor bound by the enzyme are negligible in
comparison with the total amount added, and is therefore valid even for cases of high affinity where the usual
methods fail. Besides doing away with the need for calculation, it enables the concentrations of the various
components of the system to be read off directly for any point of the velocity curve."
Das Programm Composit bietet unter der Option [I]nhibitors, [C]oncentration [E o ] =
[I o ] eine andere Lösung dieser Problematik und stellt den "Easson-Stedman-plot"
vor. 29
28 Da der Dixon plot die weiteste Verbreitung gefunden hat, haben wir seine Beschreibung im Skript
belassen; eine Demonstration seiner Eigenschaften und Grenzen ist Teil des MMenten-Programms
unter den Optionen [I]nhibitors, [R]eversible. Ansonsten empfehlen wir ihn für Praktikumszwecke nicht
mehr.
29 L. H. Easson & E. Stedman (1936), Proc. Roy. Soc. B 121, 141-164; J. Bieth (1984), Biochem.
Med. 32 387-397. Die Situation [E o ] = ca. [I] ist typisch für das System aus Protease und -Inhibitor,
welches nicht auf klassischem Wege behandelt werden kann.

86
Km/Ki
8.10 Versuch E1: Der Km-Wert der LDH-Pyruvat Reaktion; Inhibition durch
NAD + , ADP, Salicylat oder Oxamat
Substanzen: 1) Puffer
30 mM Na-Phosphat, pH 7.4
2) 20 mM Na-Pyruvat in (1)
3) 4.8 mM NADH,H + in (1)
4) 50 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!!!! Ggf. auf 7.4 stellen!) 30
5a) 75 mM Na-Salicylat (wie (4))
5b) 3 mM Na-Oxamat (wie (4))
5c) 50 mM ADP (wie (4))
6) LDH, 1-5 µl Kristallsuspension in 1 ml (1). Enzym aus Skelettoder
Herzmuskel (s. Fußnote)
Man versetze 2.7-2.79 ml des Puffers (1) mit 100 µl LDH (6) und Inhibitor (wo
zutreffend). Für diese Mischung stellt man das Photometer auf E = 0. Nach Zusatz
von 100 µl NADH,H + (3) kann die E 340 für den Reaktionsbeginn ermittelt werden. Man
starte die Reaktion durch Zugabe von 100, 50, 30, 20 bzw. 10 µl Pyruvat (2) und
registriere den Abfall der E 340 . Gesamtvolumen für alle Ansätze: 3.0 ml.
Entsprechende Versuchsreihen führe man in Gegenwart von 100, 250 und
500 µl (4) bzw. (5) durch und übertägt die gesammelten Daten in ein Lineweaver-
Burk-Diagramm der Form:
- welchen K m -Wert hat Pyruvat
mit dem reinen Kaninchenmuskel-
Enzym?
- hemmen NAD + (Salicylat,
Oxamat, Adenosinphosphate) die
Reaktion kompetitiv, nicht-kompetitiv
oder unkompetitiv? Zur Interpretation
bitte Sonderkapitel 8.13.1 beachten!
- erklären Sie den Befund, dass
Salicylat bzw. Oxamat die Substratbindungsplätze
einnehmen können
- Ist der Schritt 12 des Glycolyseschemas somit sehr anfällig gegen
Produkthemmung (NAD + ) bzw. ist er hemmbar durch Substrat/Produktanaloge?
Aus sekundären Plots der Steigung gegen die Inhibitorkonzentration bzw. der y-
30 die NAD + - Hemmung zeigt sich am besten bei Verwendung des Herzmuskelenzyms. Grund?

87
Km/Ki
Achsenabschnitte gegen die Inhibitorkonzentration werden die K i - bzw. K is -Werte
ablesbar, ein Verfahren das in MMenten demonstriert und vollzogen werden kann.
Mit gleichem oder besserem Erfolg lassen sich beide Konstanten auch in Composit
durch nichtlineare Regression direkt ermitteln. Bitte zur Dateneingabe immer die
Anweisungen aus Kap. 8.1 (Fußnote) beachten. Zuerst Datensatz für die Messreihe
ohne Inhibitor, dann diejenigen für die geringste Inhibitorkonzentration eingeben etc..
Im Zweifelsfall Beispiel-'files' inspizieren (C:\EN\IX*.*).
- Welche K i - und K is Werte haben NAD + , Salicylat, bzw. Adenosinphosphate?
31 Welches Inhibitionsmuster leiten Sie aus der Relation
dieser Werte her? Entsprechen die Schlussfolgerungen jenen aus den
vorstehenden Verfahren?
- Versuch E4: unter IX30 - IX46 wurden prototypische Inhibitions-files
abgespeichert. Jede Gruppe sollte im Rahmen dieser Versuchgruppe
zwei dieser ´files´ auswerten.
31 Bitte beachten Sie, dass K is -Werte nicht aus dem Dixon-Diagramm zu entnehmen sind. Für eine
vollständige Analyse sind durch direkt-lineare Auftragung 'bereinigte' Lineweaver-Burk Plots
anzufertigen (vergl. Kap. 8.8.6). Alternativ kann die gesamte Messreihe durch die Option [L]ink in
Makafil zu einem 'composite file' zusammengefaßt und in Composit optimiert werden (Optionen
[I]nhibition [R]eversible). Die so optimierte Messreihe erzeugt im Lineweaver-Burk Diagramm
zwangsläufig einen gemeinsamen Schnittpunkt (Ausnahme: Parallelen bei unkompetitiver Inhibition).
Graphische Darstellungen nach Lineweaver-Burk und für jedes Linearisierungsverfahren übernimmt
auch das Programm MMenten.

88
Km/Ki
Optische Tests für diese Krankheitsmarker werden im ersten Dienstagsseminar besprochen. Eine
empfohlene Übung besteht darin, das Prinzip und die Zusammensetzung der auf dem Markt
befindlichen Testkits anhand folgender Internetseite(n) nachzuvollziehen (fettgedruckte Rubriken):
http://www.merckeurolab.de/; Themengebiete; Klinische Chemie
Klinische Biochemie (Internet-Beispiel)
Die Klinische Chemie hat bei Merck eine sehr lange Tradition und basiert auf einer
großen, jahrzehntelangen Erfahrung.
Unseren Kunden im medizinischen Labor stellen wir weltweit für alle
diagnostischen Fragestellungen auf allen Indikationsgebieten ein umfassendes
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Moderne Methoden, basierend auf der internationalen Standardisierung,
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Anwenderfreundlichkeit und Packungskonzepte für den hohen und niedrigen
Durchsatz mit den entsprechenden
Applikationen auf den Analysern von heute und morgen sind weitere Pluspunkte
unserer Reagenzlinien in der Klinischen Chemie. Wir haben den Test für jeden
gewünschten Parameter.
1. Diabetesdiagnostik
2. Herzdiagnostik
3. Leberdiagnostik
4. Nierendiagnostik
5. Fettstoffwechseldiagnostik
6. Pankreasdiagnostik
7. Elektrolyte
8. Andere Reagenzien
9. Kontrollsera
10. Entzündungsparameter

89
Km/Ki
8.11 Isoenzyme der Lactat-dehydrogenase; Bedeutung in der klinischen
Biochemie (H 4 = Typ 1, M 4 = Typ 5)
Für die Diagnostik des Herzinfarktes sowie
anderer organischer Krankheiten hat die
Charakterisierung des überwiegenden LDH-
Isoenzyms im Serum besondere Bedeutung
erlangt. Die elektrophoretische Charakterisierung
(siehe Abb. links) ist am präzisesten,
jedoch auch am aufwendigsten,
da zuvor Fremdproteine abgetrennt werden
müssen. Schnelltests beruhen daher auf
unterschiedlichen thermischen Stabilitäten,
unterschiedlichen K m -Werten und unterschiedlichen
Spezifitäten (vergl. auch die
Daten in Kapitel 3.5). Die beiden letzteren
Parameter sollen in den Versuchen E2
herangezogen werden, um die Isoenzyme
in verschiedenen Geweben näher zu
charakterisieren.
Abb. 8.13: LDH-Isoenzymmuster bei
verschiedenen Krankheitsbildern
Weitere Schlüsselenzyme für die Diagnose von Gewebeläsionen sind:
- Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH); vergl. Versuch E2.1
- Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)
- Glutamat-Oxalacetat-Dehydrogenase (GOT); auch: Aspartat-Aminotransferase
(ASAT)
- Glutamat-Pyruvat Dehydrogenase (GPT); auch: Alanin-Amionotransferase
(ALAT)
- Creatin-phosphokinase (CPK); auch: Creatinkinase (CK)

90
Km/Ki
8.11.1 Versuch E2.1: "Hydroxybutyrat-Dehydrogenase"-Aktivität der LDH-
Isoenzyme in Herz und Leber 32
α-Ketobutyrat
Pyruvat-Analogon
α-Hydroxybutyrat
Lactat-Analogon
LDH vom Muskeltyp (M 4 ) diskriminiert wesentlich stärker zwischen ihren wahren
Substraten (Pyruvat und Lactat) und den Homologen Ketobutyrat und Hydroxybutyrat
als das Herzenzym. Ein schneller klinischer Test auf Herzinfarkt beruht daher auf der
"Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Aktivität" im Serum. Im Standardtest liegt der
Quotient der Aktivitäten, HBDH/LDH beim Menschen im Herzmuskel bei 1 (keine
Unterscheidung der Substrate), in den Erythrozyten bei 0.9, im Lebergewebe und der
Skelettmuskulatur zwischen 0.3 und 0.4. Im Normalserum schwankt HBDH/LDH
zwischen 0.62 und 0.82, nach einem Infarkt liegt er deutlich darüber.
Aufgabe: Bestimmen Sie den HBDH/LDH-Quotienten für die Enzyme in obigen
Extrakten. Hierzu benötigen Sie die Substanzen aus Versuch A1 sowie eine 50 mM
Lösung von Na-Ketobutyrat. Sodann bestimmen Sie die Umsatzgeschwindigkeiten
mit jedem der Substrate. Bitte ermitteln Sie, ob es sich bei den Messwerten um
wahre Aktivitäten (d.h. Messung bei Substratsättigung) handelt, oder ob die
verschiedenen Quotienten Affinitätsunterschiede reflektieren.
32 Achtung: die untersuchten Extrakte sind bitte für die an anderer Stelle vorzunehmenden K m -Wert
Bestimmungen aufzubewahren!!

91
Km/Ki
8.11.2 Versuch E2.2: Km-Werte der LDH- Isoenzyme
Aus Versuch E.2.1 besitzen Sie Extrakte aus verschiedenen Organen, für welche Sie
den HBDH/LDH-Quotienten bestimmt haben. Wählen Sie einen Extrakt aus, der
durch sein HBDH/LDH-Verhältnis (0.5-0.8) erkennen lässt, dass er Anteile beider
Isoenzyme (H und M) enthält; dies sollte im Skelettmuskelextrakt gegeben sein.
Diesen Extrakt sollten Sie zunächst so weit im Puffer aus Versuch E1 verdünnen,
dass die Aktivitäten bei Sättigung gut messbar sind. Sodann bestimmen Sie die K m -
Werte nach der in E1 gegebenen Vorschrift mit den Lösungen1-3 (keine inhibitoren!).
Da für das H 4 -Enzym (HBDH/LDH nahe 1) niedrigere K m -Werte zu erwarten sind
(Kap. 3.5) als für das Muskelenzym, sollte ein weiter Bereich an Pyruvat-Konzentrationen
(10 -4 bis 10×10 -3 M, d.h. 0.1-10 mM) untersucht werden. Da ferner das
H4 Enzym in Gegenwart von Pyruvat und NAD + das Phänomen einer Substrat- bzw.
einer "Substrat/Produkthemmung" zeigen kann, sind die Messungen bei höheren
Pyruvatkonzentrationen entsprechend zu werten. Jede Sättigungskurve ist durch
mindestens zehn Messpunkte in der Region der K m -Werte zu belegen.
- Welches sind die K m -Werte der Lactatdehydrogenase(n)?
- Ergibt die Angleichung der Messpunkte im direkt-linearen Plot das Bild einer idealen
Hyperbel?
- Führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse mit Hilfe von "Composit" durch.
Erhalten Sie einen besseren "fit" bei Verwendung der Option [D]ouble hyperbolic
anstelle von [H]yperbolic? 33 .
Sollte [D]ouble hyperbolic zwei Hyperbeln gleichen Km-Werts ermitteln, ist eine
gleichwertige Annäherung auch durch [H]yperbolic möglich. Warum?
- Sie haben den Scatchard-Plot als probates Mittel zur Diagnose nichthyperbolen
Verhaltens kennengelernt
- führen Sie in Composit die Angleichung unter [D]ouble-hyperbolic durch;
- bestätigen Sie die Option śave fitted data on disḱ mit [P]roceed und speichern Sie die
angeglichene Datenreihe (wie voreingestellt) unter ÉX́ ab;
- springen Sie in das Programm MMenten [S]ubstrate concentration / read a [F]ile
- rufen Sie (wie voreingestellt) ÉX́ auf; drücken Sie bis zum Graphik-Menu
- wählen Sie [Sc] und drücken Sie dann bis zum Erscheinen des Scatchard
Diagramms; handelt es sich um eine Gerade oder ist eine systematische Abweichung
zu erkennen?
- Sollte die Option [H]yperbolic eine optimale Angleichung ergeben: verwenden Sie ein
Gemisch (1:1 hinsichtlich der Aktivitäten) aus Leber- (M4) und Herzmuskel-Extrakt
(überwiegend H 4 ).
33 Die Option [H]yperbolic ist die Angleichung an die gewöhnliche Michaelis-Menten Gleichung
v=(V max . S)/(K m +S); die Option [D]ouble hyperbolic erledigt die Angleichung an eine doppelte Michaelis-
Menten Gleichung, i.e. v={(V max (1) . S)/(K m (1)+S)} + (V max (2) . S)/(K m (2)+S)}. Literatur: R. G. Duggleby
(1988), J. Theor. Biol.130, 123-124; die dort beschriebene Routine wurde als Option [D]ouble
hyperbolic implementiert

92
Km/Ki
V max
K2 m K1 m
V2 max
V1 max
Abb. 8.14: Zusammengesetzte Hyperbel.
Gezeigt ist die Kooperation zweier Isoenzyme mit K(1) = 1,
V(1) = 20 und K(2) = 100, V(2) =100 (File DEMO.ISO) und
der Versuch ihrer Analyse im direkt-linearen Diagramm.
Untersuchen Sie durch Computeranalyse, ob diese
Hyperbel auch durch andere Kombinationen von K m und
V max angeglichen werden kann (nach: Praktikum BB3
1998).
[Pyruvat]
Abb. 8.15: Zusammengesetzte Hyperbel
(Praktikumsbeispiel aus BB3 1999. Angleichung über
Composit ergibt die folgenden Parameter:
V(1) = 0.3
K(1) = 0.04
V(2) = 0.4
K(2)=1.5

93
Tricks
8.12 Versuch E3: Der Km-Wert der Alkoholdehydrogenase-Ethanol-Reaktion
Literatur: J. Pharm. Pharmacol. 19, 355, 1967
Substanzen:
1) Puffer: 67 mM Glycin (pH 10 mit NaOH)
2) 36 mM Ethanol (166 mg = 210 µl Ethanol ad 100 ml mit (1))
3) 50 mM NAD + (aus Versuch E1)
4a) 75 mM Na-Salicylat in (1) (pH-Kontrolle!)
4b) 20 mM AMP oder ADP in (1) ( " )
5) Alkoholdehydrogenase (ADH aus Pferdeleber); 1-10 µl
Kristallsuspension in 1 ml (1) (ausprobieren!!)
Man versetze 2.8 -2.7 ml Puffer (1) mit 0 34 , 10, 20, 30, 50 bzw. 100 µl an Ethanol (2)
sowie 100 µl an NAD + (3). Das Photometer wird auf E 340 =0 geeicht und die Reaktion
durch Zugabe von 100 µl ADH (5) gestartet. Man registriert den Anstieg der E 340 .
Gesamtvolumen für alle Ansätze: 3.0 ml.
Entsprechende Versuchsreihen führe man in Gegenwart von 50, 100 und 200
µl Inhibitor (4a bzw. 4b) durch und überträgt die gesammelten Daten in ein
Lineweaver-Burk Diagramm:
- welchen K m -Wert hat Ethanol mit ADH?
- welches Inhibitionsmuster ergibt Salicylat (bzw. AMP/ADP)?
- Wie wäre dies bei der komplementären Versuchsanordnung (konstante
Konzentration an EtOH, steigende Konzentrationen an NAD + )?
- welchen K i - bzw. K is -Wert hat Salicylat (AMP/ADP) in der ADH Reaktion?
Bitte den vollständigen Fragen- und Aufgabenkatalog unter E1
beachten.
34 Einige ADH-Präparationen werden mit Ethanol stabilisiert geliefert. In diesem Fall (überprüfen!) ist
eine Reaktion bereits ohne externe EtOH-Zugabe zu registrieren. Schätzen Sie die
Basiskonzentration an EtOH entweder in einem Kontrollansatz nach vollständiger Umsetzung oder
durch Ermittlung der EtOH-Zugabemenge, bei der sich die Anfangsgeschwindigkeit verdoppelt.
Berücksichtigen Sie d iese bei Ihren Kalkulationen.

94
Tricks
8.13 Versuch E4: Berechnung von Inhibitionskonstanten aus optimierten
Datenreihen
Unter C\EN sind auf der Festplatte Datenreihen mit den Nummern IX31-IXnm zu
Demonstrations bzw. Übungszwecken abgespeichert. Jede Gruppe sollte einen
(oder mehrere) dieser 'files' auswerten, z.B. Gruppe 1 die Datenreihe IX31, Gruppe 2
IX32 etc..
8.14 BESONDERHEITEN BEI MEHRSUBSTRATREAKTIONEN
Bisswanger (1994) "Enzymkinetik", pp 138; Voet und Voet (1992) "Biochemie", pp342;
http://de.wikipedia.com/Mehrsubstratreaktion
Die Michaelis-Menten Beziehung und einige ihrer Erweiterungen bezogen sich
ursprünglich nur auf Einsubstrat-Umsetzungen. In der Realität arbeiten typische
Enzyme mit zwei oder mehreren Co-Substraten (LDH mit NADH,H + und Pyruvat).
Die Formalismen in ihrer einfachen Form erweisen sich auch für diese Erweiterung
solange als gültig, wie man die Konzentrationsabhängigkeit nur eines Substrates
untersucht und die anderer Substrate in sättigenden Mengen vorlegt. Damit erhält
man die kinetischen Konstanten des variierten Substrats, nicht jedoch Informationen
über den Mehrsubstrat-Mechanismus (welche eine gegenseitige Variation aller
beteiligten Substrate erfordert).
Eine eingehende Beschreibung von Mehrsubstrat-Reaktionen geht auf W.
Wallace Cleland (1963) zurück.
In der Nomenklatur nach Cleland bezeichnet man Substrate in der Reihenfolge ihrer Bindung mit
A,B,C, die Produkte in der Reihenfolge ihrer Ablösung als P,Q,R. Das Enzym bildet mit Substraten
bzw. Produkten 'transitory complexes' der Form EA, EP, etc. Die Zahl der Substrate, die insgesamt
an der Hinreaktion und die der Produkte, die an der Rückreaktion teilnehmen, wird durch uni-/bi-/teretc.
benannt. LDH würde somit einem 'sequential-bi-bi' Mechanismus folgen, während
Transaminasen bzw. FAD-abhängige Dehydrogenasen (deren Coenzym durch ein Folgesubstrat zu
regenerieren ist) einem 'ping-pong-bi-bi' Mechanismus gehorchen.
Führt man enzymkinetische Messreihen, jeweils in Gegenwart einer
nichtsättigenden, aber konstanten Konzentration von A (NADH,H + ), bei steigenden
Konzentrationen von B (Pyruvat) durch, so entsteht im Lineweaver-Burk Diagramm
das Muster einer ḿixed typé Inhibition (Abb.8.14 zeigt den Idealfall eines
nichtkompetitiven Musters). Auswertung der Primärbindungsdaten (hier: drei
Hyperbeln) durch nichtlineare Regression kann im Programm DNRPeasy durch
Anpassung an die erweiterte Michaelis-Menten Gleichung für
Zweisubstratreaktionen vorgenommen Werten:
v =
Vmax[ A][ B]
K K + K [ B] + [ A][ B]
iA mB mA
Daraus resultieren K m Werte für beide Substrate, sowie ein Wert "K iA".. K iA
kennzeichnet die Bindung des Substrates A an das freie Enzym, d.h. für die Bildung
eines katalytisch noch nicht aktiven Übergangskomplexes; der Wert ist identisch mit
der Inhibitionskonstanten, die A als Produktinhibitor bei der Rückreaktion hätte.
Analoge Informationen entnahm man früher Sekundärauftragungen der ślopeś bzw.
ínterceptś des Lineweaver-Burk Diagramms (Abb. 8.14) und handelte sich damit alle
Nachteile dieses Verfahrens ein (Abb. 8.5.).

95
Tricks
Abb. 8.14; A: Substratumsatz von Pyruvat durch LDH bei drei nicht-sättigenden Konzentrationen von
NADH,H + (A 3 >A 2 >A 1 ). Im Lineweaver-Burk Diagramm entsteht scheinbar das Muster einer
nichtkompetitiven Inhibition. Schnittpunkt der Linienlinks der 1/v Achse ist typisch für einen
sequenziellen Mechanismus (8.14.1; beim Ping-Pong Mechanismus (8.14.2) entstände, analog der
unkompetitiven Inhibition, eine Schar paralleler Geraden [Voet & Voet, S. 364]). B; sekundärer Plot
der ínterceptsáus Teil A zur Bestimmung des K m -Wertes für das zweite Substrat (NADH,H + ); im
Gegensatz zu den Sekundärdiagrammen der Hemm-Mechanismen, wo direkt gegen [I] aufgetragen
wird (Abb. 8.11) ist hier die Steigung genen 1/[B] aufzutragen.
(Bisswanger "Enzymkinetik 1979, S. 118; Zeichnung nach Tabelle 2.1 in: Bisswanger „Enzymkinetik“
(1994), p137
8.14.1 Sequenzieller Mechanismus: geordnet oder willkürlich
W. W. Cleland, Biochim.Biophys.Acta 67, 104-137 (1963); Meth. Enzymol. 63, 1-65 (1975).
Nur der sequenzielle bi-bi Mechanismus, nicht aber uni-bi- oder uni-uni
Reaktionen weisen Aspekte der nichtkompetitiven Hemmung auf. Das in Abb. 8.14
gezeigte Muster des Lineweaver-Burk Diagramms gilt unabhängig davon, ob die
Substrate/Produkte in einer obligatorisch festgelegten, „geordneten“ Reihenfolge
gebunden/freigesetzt werden (́´obligatory order´́) oder ob deren Reihenfolge
willkürlich ist ('random'). Die Entscheidung zwischen diesen Grenzsituationen lässt
sich dann fällen, wenn man Kinetiken von vorn herein in Gegenwart eines der
Podukte durchführt, das die Kinetik als Produktinhibitor beeinflusst.
Eigentlich sollte man erwarten, dass ein Produkt den Umsatz des Substrates aus dem es
entstanden ist, in kompetitiver Weise (c) hemmt. Gegenüber dem Cosubstrat sollte es
nichtkompetitiv (nc) wirken, da es Anteile des Substrates verdrängt und somit maximale
Reaktionsgeschwindigkeit nicht zulässt. Tatsächlich hängt das Resultat jedoch von dem
zugrundeliegenden Mechanismus ( ´obligatory/random order´ ́) ab. Diesen Umstand nutzt
man zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus, denn es gilt:

96
Tricks
Mechanismus hemmendes variables Substrat
(bi-bi) Produkt (Cosubstrat nicht sättigend)
A(NADH,H + )
B(Pyr)
geordnet P(NAD + ) nc 35 nc 36
Q(Lac) c 37 nc 38
willkürlich P(NAD + ) c 39 c 40
Q(Lac) c c
Um einem Verständnis näherzukommen, muss man wissen (Kopfzeile Abb. 8.15):
• Im Falle des geordneten Mechanismus hat das Leitsubstrat A (NADH,H + ) vor dem
Folgesubstrat B (Pyruvat) zu binden und das Leitprodukt P (NAD + ) hat das Enzym
vor dem Folgeprodukt Q (Lactat) zu verlassen;
• gleichzeitig existieren keine Komplexe aus Enzym und Folgesubstrat bzw.
Leitprodukt (d.h. es gibt keine Komplexe EB bzw. EP; Bisswanger, 1994,
'Enzymkinetik', p. 138f). 41 Mischformen wie EAQ und EBP existieren nicht!
35
A,B treffen auf E; P kann sich nur mit EQ verbinden, was Konversion von B voraussetzt. Steigende [A] beschleunigt EPQ-Bildung
V max wird nicht erreicht, da EPQ-Dissoziation durch P behindert wird: nichtkompetitiv (nc).
36
A,B treffen auf E. P kann sich nur mit EQ verbinden, was Konversion von B voraussetzt., Steigende [B] beschleunigt EPQ-Bildung
V max wird nicht erreicht, da EPQ-Dissoziation durch P behindert wird: nichtkompetitiv (nc).
37
A,B treffen auf EQ. Da es keinen Komplex EAQ gibt, steht A in Kompetition zu Q: steigende [A] führen zur Verdrängung des
störendenden Nachbarn wobei V max erreicht wird, K m aufgrund der Kompetition jedoch steigt: kompetitiv (c).
38
A,B treffen auf EQ. Steigende [B] kann Q nicht verdrängen, da Bindung von B nur an EA erfolgen könnte. V max kann nicht erreicht
werden, da Bindungsplatz für A stets nur teilgesättigt:sein kann: nichtkompetitiv (nc).
39
A,B treffen auf EP. Steigende [A] ist in der Lage, das im selben Bindungplatz befindliche Produkt zu verdrängen, so dass V max
erreicht wird: kompetitiv (c).
40
A,B treffen auf EP. Steigende B verdrängt P aus Nachbarbindungsplatz, da EPB nicht existieren kann. V max wird erreicht, da
Dissoziation von Q aus EPQ durch P nicht behindert wird: kompetitiv (c). Usw....
41 Abb. 8.15 (umseitig): sequenzieller (= geordneter) bi-bi Mechanismus.
Das Leitsubstrat A (NADH,H + ) muss assoziiert sein, bevor das Folgesubstrat B (Pyruvat) assoziieren kann. Das
Leitprodukt P (NAD + ) muss den EPQ-Komplex verlassen, bevor Q (Lactat) aus EQ abdissoziieren kann.
Komplexe EAQ und EBP (Edukt und Partnerprodukt) gibt es igrundsätzlic nicht. Komplexe EP bzw. EB und EAQ
haben beim sequenziellen bi-bi Mechanismus keine Existenzberechtigung. Im Gegensatz hierzu
assoziieren/dissoziieren beim random bi-bi Mechanismus alle Substrate/Produkte in beliebiger Folge. Daher
würden auch Komplexe des Typs EB und EP existieren. Alle Situationen in Abb. 8.15 tragen die Nummer der
Fußnote, in der sie beschrieben werden.

97
Tricks

98
Tricks
8.14.2 Ping-pong bi-bi Mechanismus
Hier wird bereits ein Produkt nach Bindung des ersten Substratmoleküls freigesetzt („Ping“). E geht
dabei in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat bei Bildung des zweiten
Produktes reagiert („Pong“). E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphat-Komplex, der mit einer
Aminosäure reagiert, F ein Transaminase-Pyridoxamin-Komplex, der eine Ketosäure umsetzt.
Die Lineweaver-Burk Auftragung zeigt für diesen Fall die Charakteristika einer unkompetitiven
Inhibition: die katalytische Effizienz (Kap. 8.2; hier: Steigung, bzw. Quotient V max/ K m )
bleibt konstant. Hilfsvorstellung: dies ist eine Folge der Tatsache, dass der erste Substratumschlag
bereits in Abwesenheit des zweiten Substrates erfolgt, so dass die Tangente an den Ursprung einer
MMenten-Funktion ihre Steigung nicht ändert (Abb. 8.2.1).
Abb. 8.14: Verhältnisse beim Ping-pong bi-bi Mechanismus. Ein Produkt wird bereits nach Bindung
des ersten Substratmoleküls freigesetzt.
E geht in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat unter Bildung des zweiten Produktes
reagiert. E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphatkomplex, der mit einer Aminosäure reagiert, F ein
Transaminase-Pyridoxaminkomplex, der eine alpha-Ketosäure umsetzt.
TRICKS UND ' trouble-shooting'
9.1 Funktioniert das Photometer?
(Auszug aus "Boehringer Mannheim GmbH: Testfibel")
Prüfung: ca. 500 mg Kaliumhexacyanoferrat-(III) in 500 ml aqua dest. lösen (E =1). Mit aqua 1+1, 1+3
und 1+9 Verdünnungen herstellen und die vier Lösungen bei 355 nm gegen Wasser messen; die
Chemikalie weist hier ein Extinktionsminimum nahe der sonst meist verwendeten Wellenlänge von
340 nm auf. Messungen in Minima oder (vorzugsweise) Maxima sind verlässlicher als solche an der
Flanke einer Absorptionsbande. Die abgelesenen Extinktionswerte müssen sich wie 1:0.5 bzw. 1:0.25
und 1:0.1 verhalten, dann spricht das Photometer linear auf Konzentrationen (Extinktionen) an.
Die Absolutwerte der drei Lösungen sollten 1, 0.5, 0.25 und 0.1 betragen und
können zum Vergleich verschiedener Photometer untereinander verwendet werden.
9.2 Optimierung der Versuchsbedingungen bei schlecht auswertbaren
Kinetiken
Anfangssteigungen sind nicht ablesbar, weil
- die Reaktion zu schnell abläuft: Enzymkonzentration senken,
- die Reaktion zu langsam verläuft: Enzymkonzentration anheben.
falls der erwartete Endpunkt nicht erreicht wird: eines der Cosubstrate limitiert
die Reaktion,
- der Reaktionsverlauf keinen linearen Anfangsbereich aufweist: Kon-

99
Tricks
zentrationen der Cosubstrate liegen weit unterhalb der K m -Werte; höhere
Konzentrationen wählen: alle Substrate bis auf jenes, dessen K m -Wert
bestimmt wird, sollten in sättigender Konzentration vorliegen;
Falls dies alles nicht hilft:
es ist die integrierte Michaelis-Menten Gleichung im kompletter Form zugrunde zu
legen (diskutiert durch N.G. Karanth & A.K. Srivastava Biochim. Biophys. Acta 615,
279,1980):
1 Km ln( So
/ St)
1
S
= ⋅ + mit:
v =
v V max S − S V max
o
t
Diese kann z.B. zur Auswertung von 'fixed-point'-Messungen herangezogen werden (R. G. Duggleby
(1991), Biochim. Biophys. Acta 1078, 124-125); dieses Verfahren umgeht die schwierige Ermittlung
von Anfangssteigungen völlig, d.h.:
...the time to reach a predetermined product concentration, [P * ], is determined for various substrate
concentrations [S o ]. This time is given by t = [P * ]/V max -(K m /V max ) . ln(1-[P * ]/[S o ]. The fixed point which is
recommended is half the lowest substrate concentration. A plot of t vs. -ln(1-[P * ]/[S o ]) will then be a straight
line with a slope of K m /V max and an intercept of [P * ]/V max permitting the easy calculation of K m and V max .
Der Computer erweist sich hier als nützliches Hilfsmittel. Geben Sie in Composit (Optionen
[S]ubstrate/(F]ixed point method) den 'fixed point' ein. Sodann geben Sie für jede Substratkonzentration
die zum Erreichen von [P * ] erforderliche Zeit t ein und verfolgen Sie, wie der
Computer Ihnen durch nichtlineare Regression K m und V max ermittelt.
o
− S
t
t
Schließlich übernimmt der Computer auch die Aufgabe, aus einer Zeit-Umsatzkurve
die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ('Anfangssteigung') zu ermitteln. Hierfür
stehen zwei Optionen zur Verfügung:
9.2.1 Anfangsgeschwindigkeiten aus der integrierten Michaelis-Menten
Gleichung
M.J.C. Crabbe in "Microcomputers in Biology", IRL Press (1984, C.R. Ireland & S. P. Long, Ed.,
pp121
Im strikten Sinne bezieht sich die integrierte Michaelis-Menten Gleichung auf
irreversible (durch Produktanhäufung nicht inhibierte) Einzelsubstrat-Reaktionen.
Dennoch erlaubt ihre Anwendung auch für komplexere Reaktionen eine verlässliche
Ableitung der Anfangsgeschwindigkeit. Hierfür ist Kenntnis über die
Substratkonzentration zum Zeitpunkt t = 0 ([NADH,H + ] bei Reaktionsbeginn) bzw.
der Produktkonzentration zum Zeitpunkt t = 4 erforderlich. Das Programm V0
unterscheidet entsprechend einen [S]- und einen [P]-Fall. Im [P]-Fall übernimmt V0
die Abschätzung des Wertes P oo , erlaubt jedoch dessen Eingabe, sollten Daten
vorliegen.

100
Tricks
9.2.2 Anwendung eines Polynoms zur Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeit
aus Zeit-Umsatzkurven
J. T.-F. Wong, "Kinetics of Enzyme Mechanism", Academic Press 1975, pp 5
Der Verlauf der Produktkonzentration [P] während einer enzymatischen
Umsetzung kann durch ein Polynom zweiter oder höherer Ordnung, etwa der Form
[P] = a o + a 1 t + a 2 t 2 + a 3 t 3 ...
angeglichen werden, wobei durch eine wachsende Zahl an a n -Gliedern eine
zunehmend bessere Anpassung erzielt wird. Im einfachsten Fall {[P] = a o + a 1 t} hätte
man es mit der Angleichung an eine Gerade zu tun, wobei a 1 die Steigung und a o
der Ordinatenschnittpunkt wären; a 1 und a o behalten eine analoge Bedeutung auch
für ausgedehntere Exponentialreihen. Im Falle einer optimalen Anpassung wird a 1
somit zur Anfangssteigung (bzw. Anfangsgeschwindigkeit).
Anwendung: im Programm Composit findet man in der Sektion [S] die Option
[P]rogress curve (via 'power series'). Bei der nachfolgenden nichtlinearen
Regression werden die Parameter a o bis a 3 angeglichen. Der optimierte Parameter
a 1 kann dann als Anfangsgeschwindigkeit interpretiert werden. 42 , 43
1 3
1
0.48
5
Substrate
3
1
Abb. 9.1: Angleichung einer ungewöhnlichen (PFK) Zeit-Umsatzkurve vom [S]-Typ mit Hilfe eines
Polynoms vierter Ordnung.
Beispiel-file ṕrogkuŕ. Eine vorherige Substrat-Produkt-Konversion ist hier möglich, aber nicht nötig (überspringen
mit [S]kip). -0.48 entspricht der Anfangssteigung ( Tangente an den Ursprung).
42 Der Parameter a o sollte bei dieser Angleichung klein bleiben, andernfalls verliefe die Kurve nicht
durch den Ursprung (t=0/P=0). Dies kann bei einem schlecht definierten Anfangspunkt auftreten
(Phänomen eines 'offset', der so identifiziert werden kann). Verlauf der Kurve durch den Punkt 0/0
kann gegebenenfalls durch "Maskierung" des Parameters a0 "erzwungen" werden. Näheres im
Anhang (Ausführungen zu Composit).
43 Die verkürzte Gleichung in der Form Y = a o + a 1 x stellt eine Gerade dar und kann durch Festhalten
von a 2 und a 3 bei 1E-28 erzeugt werden. Zusätzliches maskieren von a o bei 1E-28 erzeugt eine
Gerade durch den Ursprung (0/0).

101
Tricks
10. ZUR BEDEUTUNG VON CYSTEINEN FÜR ENZYMATISCHE AKTIVITÄTEN
(REAKTIONSKINETIK)
Literatur: Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day Inc. (1964), S. 155
Abb. 10.1: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (NBS 2 bzw. "Ellman's Reagens”) reagiert mit freien,
deprotonierten Sulfhydrylgruppen, z.B. aus Proteinen. Für jede abreagierte Thiolgruppe wird wird ein
Thionitrobenzoat-Anion frei. Das stark gelb gefärbte Anion kann aufgrund seiner Extinktion bei 412 nm
quantifiziert werden (ε 412 = 1.36x10 4 bei pH 8). NBS 2 wird auch als reversibel modifizierendes Reagens für die
Modifikation von Proteinen benutzt. Behandlung des Phosphorylase b-Dimers ergab z.B. Thiolgruppen zweier
Reaktivitäten. Darunter hatten zwei hochreaktive Reste keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität, die jedoch
parallel zu einer Gruppe wenig reaktiver Thiole abnahm (Damjanovich und Kleppe, Biochim. Biophys. Acta 122,
145, 1966).
Sulfhydrylgruppen können, oberhalb ihres pK a -Wertes, spezifisch durch SH-SS-
Austausch mit Disulfid-Reagenzien modifiziert (oxidiert) werden. Durchführung in
8 M Harnstoff (d.h. unter denaturierenden Bedingungen im leicht alkalischen Milieu)
ermöglicht die colorimetrische Erfassung aller Cysteine eines Proteins, während im
nativen Zustand nur die exponierten bzw. aktivierten SH-Funktionen nachweisbar
sind
44
Die folgenden Versuche dienen dazu, den Gesamtgehalt von
Dehydrogenasen an Cysteinen sowie die Zahl der reaktiven bzw. an der Katalyse
beteiligten Cysteinreste zu bestimmen.
10.1 Zur Auswertung von Kinetiken für Reaktionen zweiter Ordnung
Für eine Reaktion zweiter Ordnung vom Typ
44 Anstelle eines chromogenen Substrates kann in einem solchen Ansatz auch ein fluorogenes
Substrat wie BIPM ([p-(2-benzimidazoly)phenyl]maleimid) eingesetzt werden.. Dabei ergibt sich ein
erheblicher Empfindlichkeitsgewinn, vergl. J. Bode & K. Wagner (1980) Cooperative exposure of
histone H3 thiols in core particles. Int. J. Biol. Macromol. 2, 129-136.

102
Tricks
S + R → P
gilt das Geschwindigkeitsgesetz
1)
− dS
dt
= k⋅S⋅R
mit S, R, Konzentration der Reaktionspartner zum Zeitpunkt t und k,
Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung. Integration dieser Gleichung führt zu
2)
S
o
1
− R
o
S⋅
R
ln
R⋅
S
o
o
= k⋅t
worin sich S und R noch mit Hilfe der Produktkonzentration P zum Zeitpunkt t und
den Konzentrationen zu Beginn der Reaktion, S o und R o , ausdrücken lassen:
3) S = S − P;
R= R − P
o
o
2) ist die Gleichung einer Geraden. Zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten
k wäre der rechts vom Gleichheitszeichen stehende, komplexe
Ausdruck als Funktion der Zeit aufzutragen; k entspräche unter diesen Umständen
der Steigung.
10.1.1 Reaktion zweiter Ordnung unter "Pseudo-First-Order"
Bedingungen
Ist Reaktionspartner R ein Reagens, das ohne Nachteil in großem Überschuss
eingesetzt werden kann, so ändert sich seine Konzentration im Verlauf der Reaktion
nur unwesentlich. Unter diesen Bedingungen gilt mit hinreichender Näherung:
4) R = R o (sog. "pseudo-first-order" Bedingung)
Als Konstante kann R o dann mit k zusammengefaßt werden:
5) k' = k . R o ,
wodurch sich (1) vereinfacht zu
6)
dS
− = k′⋅S
dt
Diese Beziehung ergibt nach Integration den Ausdruck
S
S
7) ln = 2. 303log
= − k′⋅
t
S
So
o
Fertigt man ein Diagramm mit log S/S o vs. t an, so folgt k' aus der negativen
Steigung:

103
Tricks
8) k' = 2,303 × m
Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung wäre dann nach (5):
k m
9) k = ′ 2303⋅ .
=
R R
o
o
10.2 Versuch F1: Titration aller Cystein-Reste an GAPDH
Substanzen:
1) 0.1 M Na-phosphat, pH 8 (z.B. ansetzen durch Mischen von 0.1 M Lösungen
von NaH 2 PO 4 und Na 2 HPO 4 )
2) 0.4 M Na-phosphat, 8 M Harnstoff, pH 8 (unbedingte pH-Kontrolle
und -Korrektur nach Harnstoffzugabe!!!)
3) 19 mg (NBS) 2 in 10 ml 1) ε 412 = 13 600
4) Enzym in einer Konzentration von 0.5 mg je ml 1) bzw. 2).
GAPDH ist in (2) aufzunehmen, auf eine Konzentration von 0.5 mg/ml zu bringen
(vergl. Kapitel 1.2.1) und zur vollständigen Denaturierung 15 min in diesem Medium
zu belassen. Man fülle 2 ml der Lösung in eine Küvette und eiche das Photometer
auf E 412 = 0. Zusatz von 50 µl des Reagenz (Lösung 3) bewirkt Gelbfärbung, die als
Extinktion bei 412 nm zu messen ist. Die erhaltene Ablesung sollte für die
geringfügige Eigenextinktion des (NBS) 2 korrigiert werden. Hierfür eicht man das
Photometer mit 2 ml (2) auf E 412 = 0, fügt 50 µl (3) hinzu und liest ab. Der korrigierte
Wert dient dann zur Ermittlung der Cystein-Zahl je 144 000 g Enzym (d.h. je mol).
Hierfür ist lediglich zu kalkulieren, wie viel fach die Molarität von NBS - jene der
vorgelegten GAPDH übersteigt.
10.3 Versuch F2: Untersuchung von Cystein Reaktivitäten in nativer GAPDH
Durchführung wie Versuch F1, jedoch in Abwesenheit von Harnstoff (Puffer 1
anstelle von 2). Da ein Endwert für E 412 auch im Verlauf von Stunden nicht zu
erreichen wäre, verfolgen Sie die Reaktion über 30 Min. und verwenden Sie als Wert
E oo die unter F1 erzielte Ablesung.
Eine kinetische Analyse des Versuches wird, wie gesagt, dadurch erleichtert,
dass unter "pseudo-first-order" Bedingungen (d.h. Reagenzüberschuss) gearbeitet
wird, denn hier gilt
− dSH [ ]
= kNBS [ ] ⋅[
SH
dt
2
]
Da (NBS 2 ) >> (SH) und damit während der Reaktion praktisch konstant ist, ergibt
sich mit k(NBS 2 ) = k' die leicht integrierbare Beziehung

104
Tricks
− dSH [ ]
SH
10) ; 11)
= k′ [ SH]; ln [ ] = − k′⋅t
dt
[ SH ]
Da der ursprünglich bereitstehende Teil an SH-Funktionen, (SH) o , der End-extinktion
bei 412 nm (E4) proportional ist und der zum Zeitpunkt t nicht reagierte Teil sich zu
E oo -E t ergibt, lässt sich formulieren:
12) E∞−E
ln
E∞ t
=− k′⋅t
o
y
= m . x
(12) ist die Gleichung einer Geraden. Folglich ergibt eine Auftragung von ln (E oo -
E t /E oo ) vs.t, im Falle gleicher SH-Reaktivitäten, eine gerade Linie; ein nicht
geradliniger Verlauf deutet auf eine zusammengesetzte Reaktion hin, wie im
folgenden Beispiel:
Abb. 10.2: Zusammengesetzte Reaktion der 13 Cys-Reste
eines Proteins.
Die Reaktivitäten sind durch folgende Geschwindigkeitskonstanten
gekennzeichnet: ḱ = 0.65 (7 Reste); ḱ = 0.048 (6 Reste). Die
"späte" Steigung (auslaufender Ast) charakterisiert die letztere
Gruppe. Subtraktion der Ordinatenwerte entlang der extrapolierten
Steigung von den gemessenen Werten ergibt die erste Gruppe.
Die Ordinatenabschnitte von 0.43 bzw. 0.57 stehen für die Reaktivitätsanteile.
Zur Ermittlung der "wahren" śecond-ordeŕ
Geschwindigkeitskonstanten wären die Werte für ḱ durch die
Reagenskonzentration zu dividieren (Gleichung 9)
nach W. J. Ray und D.E. Koshland, J. Biol. Chem. 236 (1961),
1973.
Die Kinetik der Umsetzung von GAPDH mit (NBS) 2 ist nach Art der obigen Abbildung
auszuwerten (halblogarithmisches Papier im Anlagenteil) bzw. mit Unterstützung
durch das Programm MMenten (Option Inhibition [I]rreversibel) oder auch durch das
Demonstrationsprogramm Emod.
Die eleganteste Auswertung wird allerdings über das Programm Composit (Option Inhibition
[I]rreversible) ermöglicht. Dieses Programm ist für die direkte Anpassung der Messwerte an sechs
Parameter (drei Geschwindigkeitskonstanten und drei individuelle A-Werte) eingerichtet. Bei
Problemen
kann vereinfachend durch Definition von A 3 und k 3 als 1E-28 45 sowie Maskierung dieser Werte eine
Vierparameter-Anpassung erzwungen werden.
45 Festsetzen von Parametern als "null" ist nicht erlaubt: bringt den Computer zum Absturz

105
Abb. 10.3: Reaktion der GAPDH mit (NBS) 2 (aktuelles Praktikumsbeispiel).
Links: Reaktionskinetik über 30 Minuten. Rechts: Datentransformation im halblogarithmischen Diagramm (hier:
demonstriert anhand des Programmes Emod).
- GAPDH enthält superreaktive SH-Gruppen in den aktiven Zentren, die im
Millisekundenbereich reagieren (Zahl ?) neben reaktiven SH-Gruppen nahe
den aktiven Zentren (Sekundenbereich; Zahl ?) und mäßig reaktiven SH-
Gruppen (Minuten-Stundenbereich; Zahl?).
11. APPENDICES
- Anleitung zum Gebrauch der Enzkin Programme
- Enzymkinetik in Wikipedia
- Geometrische Eigenschaften einer Hyperbel
- Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung
- Lösungsweg zur Aufgabe B0
- Halblogarithmisches Papier

106
Seminarthemen:
1. Di - Moderation der Fragensammlung “Dienstag”
1. Di (T) - Maßeinheiten enzymatischer Aktivität und deren Bestimmung (27-28, 35-
37
http://de.wikipedia.org/wiki/Michaelis-Menten-Theorie)
1. Mi Steady-State Kinetik: Besonderheiten und experimentelles Vorgehen (62-63,
http://de.wikipedia.org/wiki/Fließgleichgewicht, Lehrbücher)
1.Mi (T) - gekoppelte enzymatische Tests in der klinischen Biochemie und ihre
Alternativen (31,32)
1. Mi (T) - Welche Aussagen erlaubt die Kenntnis der freien Standardenthalpie für
enzymatische Umsetzungen und wie wird sie bestimmt? (37-41)
1. Do (T) - Eigenschaften und Anwendungen der Biolumineszenzmethode (50-51,
Skript 3:Do)
1. Fr. (T) - Phosphofructokinase: ein regulatorisches Schlüsselenzym in Tieren
(Leber) und Pflanzen (54, http://de.wikipedia.org/wiki/Phosphofructokinase)
1. Fr. Glykolytische Oszillation in Hefe (Analyt. Sci. 17 Suppl i363-i366 2001)
1. Fr. (V) -Phosphofructokinase: wie erfasst man Regulation und Allosterie (56-61)?
1. Fr. (T) - Allosterie und Kooperativität (72, http://de.wikipedia.org/wiki/Allosterie
http://de.wikipedia.org/wiki/Kooperativität)
1. Fr. (T) - zur "katalytischen Effizienz": Konzept und Aussagekraft (63-65)
2. Mo (T) - Proteinbestimmungsverfahren: Grundprinzipien, Anwendbarkeit und
Einschränkungen (10-16);
2. Mo (T,P) - Proteinaufreinigungsverfahren am Beispiel der GAPDH
2. Mo. (T) - Glycolyseenzyme: ein einziger Multienzymkomplex? TIBS 13, 486-490 1988;
Science 234, 1081-1086, 1986, http://de.wikipedia.org/multienzymkomplexe
2. Di (T) Was weiß man über den katalytischen Mechanismus der GAPDH? (23)
2. Di (T) Die vielen Gesichter der Aldolase (Mol. Cell 11, 885-894, 2003; Science 304, 248-253
2005)
2. Di (T) GAPDH, ein Protein mit vielfältigen Funktionen (Biochem. Biophys. Res. Commun. 275,
253-260 2000, Cell 114, 150-152, 2003)
2. Di. (T,V) - Was sagen uns sekundäre plots? (83, 95)
2. Mi. (T) - Linearisierungen der Michaelis-Menten-Gleichung: Aussagekraft und
Limitationen (71)
2. Mi.16 (T) - Besonderheiten von Mehrsubstrat-Reaktionen 94-98
http://de.wikipedia.org/wiki/Mehrsubstrareaktion

107
Enzkin
Enzymkinetik und -mechanismus
(BB3 2005) 46
Bootdiskette oder: Installieren (INSTALL\)
DOS-Programm über EN\ starten
I -
Hinweise zum Installieren der Programme:
a- direkt von Diskette ́booteń (z.B. Diskette in Laufwerk A, Warm- oder Kaltstart des IBM
Computers 47 ) oder:
b- Automatisches Installationsprogramm ÍNSTALĹ von der Diskette aufrufen oder Installation
manuell vornehmen, d.h.
c- auf der Festplatte die Verzeichnisse EN, EN/PR, EN/UT anlegen
- dort hinein alle Dateien von den entsprechenden Verzeichnissen der Diskette kopieren 48 ;
- Batch-Datei EN.BAT in das Stammverzeichnis kopieren; ggf. ṕath́ um Hinweis auf DOS-
Verzeichnis (\dos o.ä.) erweitern, z.B.
c:\
path \en;\en\ut;\en\pr;\ut;\dos
graphics
sk
cls
banner EnzKin /d/h/u
echo Enzyme Kinetics
echo by Jürgen Bode {2000}
cd\en
auto
- Programmmenu über den Befehl EN\ aufrufen;
46 Vervielfältigen der EnzKin-Diskette:
- Windows95/98/NT: Arbeitsplatz/Diskette (A:)/Datei/Diskette kopieren
Quelldiskette
Zieldiskette
3.5-Diskette (A:) 3.5-Diskette (B:)
- DOS: A:
DISKCOPY
47 Lauffähigkeit der DOS-Programme wurde für Windows 3.*, 9*, 2000 und ME getestet und bestätigt
48 Alle lauffähigen Programme finden sich in \en\pr und können auch durch direkten Aufruf gestartet werden.

108
II -
a -
b -
Aufzeichnen und Abspeichern von Messdaten
über die Dateneingaberoutine, die (fast) jedem Programm mitgegeben wurde;
alle Files werden automatisch im Verzeichnis \EN abgelegt
über die generelle Dateneingaberoutine ḾAKAFIĹ die verschiedene in COMPOSIT verlangte
Formate anlegt. Die dort gestellten Fragen sind wie folgt zu beantworten:
- [C]reate, [L]ink or [C]onvert files : C\
Funktion [L]ink kommt erst bei Inhibitionsstudien zum Tragen. Dort können mehrere
einzelne Messreihen zu einem ćomposit filé vereinigt werden. Funktion [C]onvert
bereitet den Import/Export von Datenreihen aus/in andere(n) Programmen vor.
- enter number of data sets 61> : \
Jede Messreihe ist ein Datensatz (́default́= 1). Abweichende Angaben nur bei
Inhibitionsmessungen.
- number of data points in set 1 (Beispiel : 5 \ )
bei fünf Messpaaren der Art Źeit, Extinktioń.
- enter x, y (Beispiel : 2, 0.8 \ )
für eine Messung nach 2 Minuten von 0.8 Extinktionseinheiten. Eingabe von
Messreihen immer mit dem ersten Messpunkt (kleinster Wert x) beginnen. Keinen (!)
Wert 0, 0 eingeben.
c -
mit Hilfe eines beliebigen Text-Editors im ASCII Format (z.B. "Edit", "Wordpad")
nach gleichzeitigem Druck beider śhift́ Tasten kann über die [N]otizbuch-Funktion ein
einfacher Texteditor ("Sidekick") aufgerufen werden. Dieser kann zur Eingabe von
Werten oder zur Korrektur bereits vorhandener Datenfiles benutzt werden.
In der [N]otizbuchfunktion werden am oberen Rand alle unter \EN abgespeicherten Files angezeigt.
Durchblättern mit / und Pfeiltasten. Neueingabe eines Files: drücken und und
neuen File-Namen angeben. Falls kein File dieses Namens vorhanden, entsteht beschreibbares Leerfeld.
Zum Trennen der X/Y Werte reicht ein Druck auf die Taste (einfach in Musterfiles SIMPLE.FIL
und COMPOSIT.FIL ansehen). Abspeichern mit .
Rückkehr zur Übersicht ; Eingabe ́*.*́.
Formatbeispiel śimple filé (SIMPLE.FIL):
5 Zahl der (x, y) Messpunkte
1 1.1 Wertepaar (x, y), z.B. (Zeit, Extinktion)
2 1.9
4 2.9
8 4.1
16 4.9
Formatbeispiel ćomposite filé (Inhibitionsmessungen; COMPOSIT.FIL)
2 Zahl der ́data setś
4 Zahl der Messpunkte in śet 1́
0 śide conditionś (Inhibitorkonzentration)
.02 10
.025 13.5
.03 17.5
.1 30
4 Zahl der Messpunkte in śet 2́
5 śide conditionś (Inhibitorkonzentration)
.02 2.5
.025 3.3
.03 4
.1 5.3

109
Bitte alle im Praktikum generierten Daten nach folgendem Schema abspeichern (Beispiel):
G2E1.050
(Für: Gruppe 2/VersuchE1/Inhibitorkonzentration 50.)
Bitte beachten (!!)
- Alle Datenfiles aus dem Praktikum sollten mit dem Buchstaben “G” beginnen, damit sie später gemeinsam
kopiert bzw. gelöscht werden können);
- bitte im Protokoll auf diese Datenreihen Bezug nehmen (den Betreuern zuliebe, die gerne wissen,
auf welcher Grundlage ein Ergebnis/eine Interpretation beruht).
III Einlesen gespeicherter Messdaten
Eine typische Eingangsfrage der Programme lautet
enter [D]ata, use the [E]xample or read a [F]ile
Das Einlesen eines files wird durch den Tastendruck F \
eingeleitet.
Tastendruck D \ : Aufrufen der mitgegebenen Dateneingaberoutine;
Tastendruck E \ : Aufrufen eines Arbeitsbeispiels. Mit Hilfe dieses Beispiels wurde das
jeweilige Programm entwickelt. Ein Probelauf mit dieser Option sollte eine detaillierte
Gebrauchsanweisung ersetzen.
IV Abspeichern angeglichener Messdaten
Die meisten Programme gleichen die Messdaten durch “nichtlineare Regression” an ein
mathematisches Modell an. Somit wird aus dem obigen Formatbeispiel śimple filé z.B. ein file
5
1 1.117694
2 1.902887
4 2.933184
8 4.022024
16 4.938678
Dieser ́file ẃird nach der Abfrage
save fitted data on disk
[P]roceed or [S]kip
durch Tastendruck P \ gespeichert und steht dann für die weitere Bearbeitung in anderen
Programmen zur Verfügung. Bei diesen “anderen Programmen” ist z.B. an graphische Routinen mit
hoher Auflösung (z.B. GraphPad, Excel) gedacht.
In allen Programmen wird eine vorgeschlagene Option durch P \ eingeleitet bzw. durch S \
übersprungen. Wo vorhanden, erfolgt durch Q \ (für [Q]uit) ein Rücksprung an den
Programmanfang und durch M \ (für [M]ain menu) ein Sprung in das Programmmenu.
V Ausdrucken von Graphiken
... unter DOS
Je nach Rechner oder drücken. Bildschirminhalt wird auf den
Matrixdrucker (LPT1) geleitet. Zum Ausdruck von Graphen muss GRAPHICS.COM
vorinstalliert sein (ist bei unserer Standardeinstellung der Fall).
...unter WINDOWS
- Bild verkleinern mit (Bild darf nicht formatfüllend sein !)
- Taste drücken der Bildschirminhalt wird in die Zwischenablage kopiert;
- MS-Paint öffnen, Bildschirminhalt in das Fenster übertragen (Befehl EINFÜGEN oder
PASTE)
- ggf. Farben invertieren:
” Klicken Sie im Menü "Bild" auf "Farben umkehren".

110
Jede Farbe wird durch die entsprechende Komplementärfarbe ersetzt. Beispielsweise wird aus Weiß die Farbe
Schwarz, aus Rot wird Blau.
- relevanten Bildteil ausschneiden und mit KOPIEREN/EINFÜGEN (bzw. COPY/PASTE) in
das gewünschte Textverarbeitungsprgramm (oder ein neues MS-Paint-Fenster) übertragen.
Jetzt kann gedruckt werden.
... Alternative bis WINDOWS 98:
verkleinert den Bildschirminhalt und zeigt am oberen linken Rand des Bildes das
MSDOS Symbol, dem hier eine besondere Bedeutung zukommt.
- MSDOS Symbol anklicken, im Menu "BEARBEITEN" "MARKIEREN" wählen;
- den ausgewählten Bereich markieren (Maus&linke Taste oder &Pfeiltasten)
- erneut MSDOS Symbol anklicken, im Menu "BEARBEITEN" "KOPIEREN wählen.
oder (wenn vorhanden):
- Symbol für "MARKIEREN" in der Taskleiste anklicken; Graphik markieren;
- Symbol für "KOPIEREN" in der Taskleiste anklicken;
Bildschirminhalt ist in die WINDOWS Zwischenablage gewandert und kann in WINDOWS-Graphik und
Textverarbeitungsprogrammen mit den Befehlen BEARBEITEN/EINFÜGEN abgerufen werden. Vor dem Drucken
sind die Farben des Diagramms ggf. zu invertieren, um das Dokument "schwarz-auf-weiß" zu erhalten. Eine einfache
Möglichkeit hierfür bietet MS Paint unter der Option "BILD/FARBEN UMKEHREN (VI).
VI Bildbearbeitung
So invertieren Sie die Farben in einer Grafik (in Programmen, die Bitmaps verarbeiten
können):
MS Paint
” Klicken Sie im Menü "Bild" auf "Farben umkehren".
Anmerkung: Jede Farbe wird durch die entsprechende Komplementärfarbe ersetzt. Beispielsweise
wird aus Weiß die Farbe Schwarz, aus Rot wird Blau.
Corel Word Perfect
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend
auf "Bild-Tools";
” um die Farben einer Grafik in ihre Komplementärfarben umzuwandeln, klicken Sie
auf "Farbattribute" und anschließend "Farben invertieren".
Um die Farben wieder in die Originalfarben umzuwandeln, klicken Sie erneut auf "Farben invertieren".
Corel Presentations
- Version 7
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend
auf "Format/Bildvorgaben/Invertieren";
- Version 8
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend
auf das Wort „Grafik“ in der Symbolleiste. Untermenus: „Bildeinstellung/invertieren“
VII Was mache ich wenn....
....ich den Sinn einer vom Computer vorgeschlagenen Option einfach nicht verstehe:
- die nächstliegende Option/Abfrage befindet sich immer in Bildschirm-Mitte. Was auch n och
möglich ist, findet man am unteren Rand; falls auch dies nicht hilft:
- einfach \ (ŕeturń) drücken. In den meisten Fällen gelingt es, den Computer eine plausible
Option ausführen zu lassen.
....ich aus einem Programm (z.B. aufgrund eines Fehlers) nicht mehr herauskomme:
so lange \ (ŕeturń) drücken, bis die nächste Frage gestellt wird. Dann (bzw.
) drücken, um in das Programmmenu zurückzuspringen.

111
Wegweiser anhand des " Composit"-Programms in fünf
einfachen Schritten (‘)
‘ Programmaufruf (́3́ drücken oder Pfeil positionieren und \)
‘ Ś́ drücken
denn es soll der Einfluss der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt, d.h. aus der
hyperbolen Abhängigkeit des v von [S] soll die Michaeliskonstante (K m ) und die Sättigungsgeschwindigkeit (V max )
durch nichlineare Regression abgeleitet werden;
‘ ́H́ drücken
Angleichung der Messwerte an eine Hyperbel; alle Funktionen sind mit einem fest-́verdrahteteń Beispiel (́[E]xamplé)
versehen, das an dieser Stelle aufgerufen werden kann;
‘ É́ drücken
es folgt eine Reihe Optionen, die separat aufgerufen werden können. Für einen ersten Schnelldurchgang reicht es
hingegen, jede Frage durch einen Tastendruck
‘ ́\́ (ŕeturń; mehrfach)
zu quittieren. Der Computer trifft damit eine plausible Auswahl und zeigt in dieser Reihenfolge:
- eine Graphik mit den anzugleichenden Messdaten (Abb. 11.1 links)
- Schätzwerte für K m und V max
- automatische Übernahme der Schätzwerte (eine eigene Eingabe wäre möglich)
- unbeschränkte Parametervariation (ḿaskiereń, d.h. Festhalten eines Parameters und
Festlegen von Parametergrenzen, ́boundś, ist möglich, siehe nächstes Kapitel);
- Verbesserung der Schätzwerte (Minimierung der Summe der Fehlerquadrate, ŚSQ́ in
zehn Durchgängen; Angabe der optimierten Parameter);
- Abweichungen zwischen Messwerten und optimierten Werten der
Reaktionsgeschwindigkeit ́v ́;
- die Möglichkeit, ́v́-Werte für nicht gemessene Substratkonzentrationen [S] zu
interpolieren;
- die Werte für die angeglichene (optimierte) Hyperbel abzuspeichern
z.B. um sie in einem externen Graphikprogramm weiter zu verarbeiten oder für Klausuraufgaben verfügbar
zu haben (!);
- explizite Angabe der optimierten Werte für K m und V max (zum Notieren), sowie die
optimierten Messwerte (z.B. für eine Graphik per Hand);
- eine Graphik, in die zuerst die Originalmesswerte, dann die angeglichenen
Messwerte eingezeichnet werden. Diese Graphik kann durch betätigen der ́Drucḱ-
Taste ausgegeben werden.
Abb. 11.1: Angleichung enzymkinetischer Messwerte (links) durch nichtlineare Regression im
Programm Composit
links: die Originalmesswerte, die an eine Hyperbel (d.h. die MMenten-Beziehung v = V max x
[S]/(K m +[S]) angeglichen werden sollen (́fitted hyperbolá);
rechts: Überlagerung der Originalmesswerte durch die Hyperbel, die durch die geringste Summe der
Fehlerquadrate (ŚSQ́) gekennzeichnet ist. Darunter findet sich ein weiteres, extremes (typisches?)
Beispiel (ÉX0́ aus der abgespeicherten Sammlung von [F]iles.

112
Möglichkeiten beim Gebrauch der Funktionen „mask“ und „bounds“ im
Programm [C]omposit
[C]omposit generiert, zur Durchführung der linearen Regression, Schätzwerte der
anzugleichenden enzymkinetischen Parameter (́definitions and estimateś). Diese können der
Reihe nach durch übernommen werden und erscheinen dann unter énter
estimates of the parameters...́. Statt der Übernahme können an dieser Stelle auch eigene
Schätzwerte eingegeben warden. Anschließend gibt es die Möglichkeit, einzelne oder alle
dieser Schätzwerte zu maskieren (ḿask parameter #́) oder Grenzen (́boundś) vorzugeben,
die bei der Variation eingehalten werden.
Nichtlineare Regression für das
unter [C]omposit/[S]ubstrate/
c[O]operative (Hill) eingestellte
[E]xample. Durch Maskieren des
max Wertes wird eine Anpassung
an drei (statt vier) Parameter erzwungen.
́boundś für n H veranlassen dessen
Variation zwischen den Werten
„null“ und zwei.
ḿasḱ: Im Beispiel der Abb. wurde V max mit großer Sicherheit als ́150́ bestimmt. Der Wert
wird also fixiert (maskiert), d.h. es werden nur die verbliebenen drei Parameter für die
Variation freigegeben.
Es gibt die Möglichkeit, sämtliche Parameter zu definieren und zu maskieren. Der Computer nimmt
dann keine Regression vor, sondern konstruiert eine Bindungskurve zu den vorgegebenen Werten.
Wird die Funktion ́4: offset́ freigegeben, so versucht der Rechner, durch Parallelverschiebung der
Nulllinie eine bessere Anpassung zu erreichen (eine unrichtige Nulllinie kann die Folge
systematischer Messfehler sein!).
́boundś: Die Option gibt Grenzen vor, innerhalb derer bei der nichtlinearen Regression
variiert warden darf. Im Beispiel der Abb. wird der Hill-Koeffizient n H für eine Variation
zwischen [Z]ero und 2 freigegeben.
z.B. da es sich um ein dimeres Protein handelt, bei dem n H aus physikalischen Gründen einen Wert 2
nicht überschreiten kann. Eine untere Grenze [Z]ero, hier 1E-28, verhindert, dass negative Hill-
Koeffizienten (d.h. solche ohne reale Bedeutung) ausgegeben werden.
Angabe einer ĺower bound́ [Z]ero und einer úpper bound́ [I]nfinite würde Variation des Parameters im
positiven Bereich erzwingen. Solche Vorgaben können sinnvoll sein, wenn der Rechner z.B. eine
optimal Anpassung für negative K m -Werte findet. Bitte beachten: die Werte ́0́ oder ́4́ würden den
Rechner unweigerlich zum Absturz bringen, Stattdessen wird ein sehr kleiner (1E-28) bzw. ein sehr
großert Wert (1E28) eingesetzt. Diese Werte sind unteŕ [Z]́ bzw. ́[I]́ voreingestellt.
Beispiel:
Die Bindungskurve des Phenylalanins an Pyruvatkinase in File "Pk-Phe6" (analy. Abb. 7.4)
gibt nach Regression in Composit/[S]ubstrate concentration/[C]ooperative (Adair) die
folgende annehmbare aber physikalisch blödsinnige Angleichung (negative K m -Werte!):
final reports...
Vmax(1) = 100.6784 +/- 5.228411
Km(1) = -156.8362 +/- 936.9321
Km(2) = -.1200704 +/- .7006505
Verwendung der Option ́boundś (Grenzen zwischen "zero" und "infinite") nach folgendem

113
Muster
enter estimates of the parameters...
1 : 100.958
2 : 2523.701
3 : 1.25
mask parameter #
bounds for parameter #2
lower bound ? z
upper bound ? i
bounds for parameter #3
lower bound ? z
upper bound ? i
bounds for parameter #
[A]ccept default set [I]nfinite set [Z]ero
ergibt hingegen deutliche Anzeichen positiver Kooperativität:
final reports...
Vmax(1)= 101.7576 +/- 5.637818
Km(1) = 444.5495 +/- 7681.398
Km(2) = 4.378854E-02 +/- .7631205
Bitte beachten: die ungewöhnlich großen Fehlergrenzen zeigen an, dass hier viele
Kombinationen von Km zu einem ähnlich guten ́fit́ führen würden, der Datenbereich/die
Datenqualität also nicht für eine eindeutige Festlegung ausreicht. Dies kann man durch
unterschiedliche Ergebnisse für verschiedene Eingangsschätzungen demonstrieren.
Demonstration ist auch dadurch möglich, dass Angleichung an eine berechnete Kurve für
V max = 102; K m (1)= 445; K m (2)=.04 (auch ohne Setzen von ́boundś) die folgenden Werte
liefert:
final reports...
Vmax(1)= 102.0077 +/- 4.379309E-03
Km(1) = 432.1519 +/- 6.204851
Km(2) = 4.119895E-02 +/- 5.96386E-04
Übungsaufgabe: Bestimmung der Anfangssteigung einer nichtoptimalen
Enzymkinetik
1 - Schätzen Sie die Anfangssteigung dadurch ab, dass Sie eine Tangente an den Ursprung
(t=0; E=0) legen. Verfahren: Skript, Abb. 4.1.
2 - Bemühen Sie das Programm VO im Programmpaket, d.h.
- Sie haben es hier mit der Bildung von [P]rodukt zu tun;
- Sie möchten Messdaten eingeben [RET];
- Sie geben Messdaten ein (jedes Datenpaar X,Y besteht aus einer Zeitangabe und
der entsprechenden Extinktion; beide Werte sind durch ein Komma zu trennen);
- das Programm benötigt eine Abschätzung für A ; wenn Sie [RET] drücken, nimmt es
diese Abschätzung automatisch vor;
- das Programm nennt Ihnen den Schätzwert für Vo; die Bedeutung dieses Wertes ist
im Skript Abb. 4.2, erklärt; [RET]:
- das Gleiche in graphischer Darstellung analog Abb. 4.2

114
3 - Stimmt Ihre Abschätzung (Tangente an den Ursprung) mit der Computer-Angabe
überein? Diskussion!
Enzymkinetik und -Mechanismus in Wikipedia
http://de.wikipedia.org/wiki/~
anstelle des "~" bitte einsetzen:
Affinität
Allosterie
Base (Chemie)
Biochemische Zyklen
Cori-Zyklus
Crabtree-Effekt
Cyclisches_Adenosinmonophosphat
Energieladung
Enzymaktivität und katalytische Effizienz
Enzymhemmung
Enzymkinetik
exergon
Fließgleichgewicht
Freie Enthalpie*) (http://de.wikipedia.org/w/wiki.phtml?title=Freie_Enthalpie&oldid=2416152 )
Gluconeogenese
Glukose-Stoffwechsel
Glucokinase
Glykolyse
Gruppenübertragungspotential
Insulin
Isoenzym
Kooperativität
Mehrsubstratreaktion
Methode der kleinsten Quadrate (Abschnitt "Enzymkinetik")
Michaeliskonstante
Michaelis-Menten-Theorie
Milchsäure
Milchsäuregärung
Multienzymkomplexe
Oxalessigsäure
Pasteur-Effekt
Phosphofructokinase
Pyruvat
Redox-Potential
Regressionsanalyse*)
(http://de.wikipedia.org/w/wiki.phtml?title=Regressionsanalyse&oldid=1984504 )
Second Messenger
Substratzyklus
Wechselzahl

115

116
Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung (Komponeten in Ćomposit́)
V max × [ S]
v =
Km + [ S]
V
v =
K
1
1
× [ S]
V
+
+ [ S]
K
V max × [ S]
v =
Km + [ S]
nH
2
2
nH
× [ S]
+ [ S]
Hyperbol (Michaelis-Menten)
Doppelt-hyperbol (Isoenzyme)
Kooperativ (Hill )
v =
v =
V max × [ S]
2
[ S ]
Km + [ S] × ( 1 + )
Kis
Vmax[ A][ B]
K K + K [ B] + [ A][ B]
iA mB mA
Substratinhibition
Mehrsubstratreaktionen (8.14)
Allgemeine Inhibitionsgleichung (mixed type)
v =
V max × [ S]
Km(
1+ [ I]
Ki
) + [ S ]( 1+
[ I]
Kis
)
” Kis 6 4 : kompetitiv
” Ki 6 4 : unkompetitiv
” Ki = Kis : nicht-kompetitiv
Kooperative Bindung nach Adair
(hier: allosterisches Protein mit zwei Bindungsplätzen)
V max( a+
2b)
v =
21 ( + a+
b)
a = 1
K
× [ S ]
1
b = 1
K
× 1
2
K
× [ S ]
1 2

117
Lösungsweg zu Aufgabe B0 nach: Lehninger „Biochemistry“ (1979) pp425
Spaltung von Fructose1,6-Bisphosphate zu Dihydroxyacetonephosphate (DAP) und
Glycerinadehyd-3-phosphate
Diese Reaktion wird durch das wohlbekannte Enzym Fructosediphosphat Aldolase
katalysiert, das leicht in kristalliner Form aus Kaninchenmuskelextrakt zu gewinnen ist. Der
Reaktionstyp ist der einer reversible Aldolspaltung, aus welcher zwei verschiedene
Triosephosphate hervorgehen:
Fructose1,6-bisphosphat
89 ∆G°' = +5.73 kcal mol-1
Dhydroxyacetone phosphate + D-Glycerinaldehyd3-phosphate
Obgleich der ∆G 0 ' Wert dieser Reaktion stark positiv ist, verläuft die Reaktion unter
zellulären Bedingungen ohne Schwierigkeiten. Dies soll im folgenden durch zwei Ansätze
belegt werden:
A – Berechnen Sie ∆G für den Fall, dass die Konzentration aller Reaktionspartner 1E-3 M
beträgt:
∆G = ∆G ó + RT × ln[P]/[S]
= ∆G ó + RT × ln[(1E-3 x 1E-3)/1E-3]
= ∆G ó + RT × ln1E-3
= 5.73 + 1.99E-3 × 298 × (-6.9)
∆G = +1.61 kcal/mol
B – Berechnen Sie, welchen Anteil DAP und GAP in einem Gleichgewicht haben, in dem
F1.6BP in folgenden Konzentrationen vorliegt:
(a) 1.0 M („Standardbedingungen“)
(b) 0.1 M,
(c) 0.01 M
(d) 0.001 M,
(e)0.0001M.
zuerst wird aus ∆G ó die Gleichgewichtskonstante K ermittelt (Programm "G0"), damit die
Gleichgewichtskonzentration von GAP und DAP bei der jeweiligen F1.6-BP Konzentration:
∆G ó= -RT × lnK
5.73 = -1.99 E-3 × 298 × lnK
5.73 = - 0.59 × lnK
-9.71 = lnK
6E-5 = K
6E-5 = [DAP][GAP] = x 2
1E-3 1E-3
6E-8 = x 2
2.4E-4 = x
In Gegenwart von 1 mM F-2.6BP liegen 0.24 mM DAP bzw. GAP vor (24%)
(a) 0.79% („Standardbedingungen“)
(d) 24%
(b) 2.48%
(e)53.9%
(c) 7.63%
Wenn eine Reaktion mehr Produkte hervorbringt als sie Substrate umsetzt (oder umgekehrt), dann hängt die
Gleichgewichtssituation entscheidend von den Ausgangskonzentrationen ab. Für diesen Fall ist ∆G o’ (K eq ) direkt kein
hilfreicher Parameter. Er sollte dann für die Berechnung der aktuellen Gleichgewichtskonzentrationen benutzt
werden.

118
Index - Stichwortverzeichnis
α-Ketobutyrat .........................................................................................................................90
Transaminase ...........................................................................7, 24, 91, 99, 115, 116
α-Hydroxybutyrat........................................................................................................90
1,3-Bisphosphoglycerinsäure...................................................................................................8
AKTIVITÄTSTESTS...............................................................................................................26
Aldolase und GAPDH.................................................................................................31
Aldolase und Triose-P-Isomerase..............................................................................32
enzyme unit................................................................................................................35
Folin-Ciocalteau-Reagens..........................................................................................35
GAPDH ......................................................................................................................34
GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN....................................................26
Lactat-Dehydrogenase...............................................................................................29
PGK und GAPDH.......................................................................................................30
spezifische Aktivität....................................................................................................35
Triosephosphat-Isomerase ........................................................................................32
Volumenaktivität.........................................................................................................35
Aldolase ...............................................................................................................................117
Alkoholdehydrogenase-Ethanol-Reaktion..............................................................................92
Bicinchoninsäure....................................................................................................................12
Biuret......................................................................................................................................16
Biuret-Methode ......................................................................................................................10
Biuretreaktion.........................................................................................................................12
Bradford .................................................................................................................................16
BSA..................................................................................................................................11, 16
Extinktion....................................................................................................................11
Coenzym................................................................................................................................19
Composit..............................................................................................................................111
Wegweiser ...............................................................................................................111
Dehydrogenasen....................................................................................................................19
Coenzyme ..................................................................................................................19
Diphosphoglycerinsäure (heute: Bisphosphoglycerinsäure)....................................................8
direkt-lineare Auftragung........................................................................................................75
Dixon-Auftragung ...................................................................................................................85
Ablesung von Ki-Werten ............................................................................................85
EDTA .......................................................................................................................................8
ELISA-Reader........................................................................................................................13
energy charge ("Energieladung")...........................................................................................22
Enzkin (http://enzkin.de.vu) ....................................................................................................108
Installieren................................................................................................................108
enzyme unit........................................................................................................................8, 35
Enzymhemmung ..............................................................................................................76, 82
allosterische Hemmung..............................................................................................78
kompetitive Hemmung ...............................................................................................77
mixed-type" Hemmung...............................................................................................79
Nomenklaturvorschläge .............................................................................................82
unkompetitive Hemmung ...........................................................................................80
unkompetitive" Hemmung ..........................................................................................80
Enzymsättigung .....................................................................................................................20
Extinktion .................................................................................................................................8
Extinktionsänderung ∆E.........................................................................................................35
Extinktionskoeffizient .............................................................................................................21
Dimension ..................................................................................................................21
Einheit ........................................................................................................................21

119
GAP-Lösung 33
Standardisierung ........................................................................................................33
GAPDH ..................................................................................................................................19
Racker-Bande ............................................................................................................19
GAPDH-NAD+ Komplex ........................................................................................................19
Racker-Bande ............................................................................................................19
Glucagon................................................................................................................................21
Gluconeogenese....................................................................................................................25
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase .......................................................................23
Inhibitoren ..................................................................................................................24
Physikalische Daten des Apoenzyms ........................................................................24
Glycolyse-Enzyme .................................................................................................................17
Hydrazin.................................................................................................................................29
Hydridion................................................................................................................................19
Hyperbol (Michaelis-Menten) .........................................................................................94, 115
Hyperbol (Michaelis-Menten) ...................................................................................116
Inhibitionskonstanten .............................................................................................................93
Isoenzyme..............................................................................................................................91
Km-Werte ...................................................................................................................91
katal .......................................................................................................................................35
kooperativer Bindungsphänomene ........................................................................................73
Lactatdehydrogenase ............................................................................................................25
Lambert-Beersches Gesetz .............................................................................................21, 35
LDH-Reaktion ........................................................................................................................30
Gleichgewichtslage ....................................................................................................30
Lineweaver-Burk Diagramm ..................................................................................................95
Lowry .....................................................................................................................................16
Lysozym...........................................................................................................................11, 16
Extinktion....................................................................................................................11
Mehrsubstrat-Reaktionen.......................................................................................................94
MEHRSUBSTRATREAKTIONEN ..........................................................................................94
Transaminase ...........................................................................................................98
Ping-pong bi-bi Mechanismus....................................................................................98
Random/sequentieller bi-bi Mechanismus .................................................................95
W. W. Cleland ............................................................................................................95
Michaelis-Menten Gleichung ...............................................................................................100
Anfangsgeschwindigkeit.....................................................................................99, 100
Molarität ...................................................................................................................................9
molare Aktivität ......................................................................................................................28
Muskelextrakt.........................................................................................................................28
Präparation.................................................................................................................28
NAD+ ...............................................................................................................................19, 21
Extinktionskoeffizient..................................................................................................21
NADH,H+ .........................................................................................................................20, 21
Extinktionsbande........................................................................................................20
Extinktionskoeffizient..................................................................................................21
Fluoreszenz................................................................................................................20
Nicotinamid-adenin-dinucleotid..............................................................................................19
optische Dichte ........................................................................................................................8
PFK ........................................................................................................................................22
Aktivitätsprofil .............................................................................................................22
Effektoren...................................................................................................................22
Struktur.......................................................................................................................22
Regulation ..................................................................................................................54
Kinetik ........................................................................................................................57

120
Phosphofructokinase: siehe PFK...........................................................................................21
Photometer ............................................................................................................................99
Störungen...................................................................................................................99
Ping-pong bi-bi Mechanismus................................................................................................98
Polynom 100
Anfangsgeschwindigkeit...........................................................................................100
Proteinbestimmungsverfahren ...............................................................................................16
Präzision ....................................................................................................................16
Proteingehalt..........................................................................................................................10
Bicinchoninsäure-(BCA-)Variante ..............................................................................12
Biuret-Methode...........................................................................................................10
Bradford-Test .............................................................................................................14
Coomassie Brillant Blue .............................................................................................14
Eichreihe ....................................................................................................................11
ELISA-Reader ............................................................................................................13
Fluram (Flurescamin)-Methode..................................................................................13
Folin-Ciocalteau-Reagens..........................................................................................11
Methode nach Lowry..................................................................................................11
UV-Methode ...........................................................................................................8, 10
Pyruvatkinase ........................................................................................................................24
Reaktion zweiter Ordnung ...................................................................................................103
Auswertung ..............................................................................................................103
Pseudo-First-Order" Bedingungen ...........................................................................103
Salicylat..................................................................................................................................93
Schreibergeschwindigkeit ......................................................................................................28
sekundäre Plots .....................................................................................................................83
Substratinhibition ...................................................................................................................26
Substratsättigung ...................................................................................................................62
Substratumschlag ..................................................................................................................35
Tangente an den Ursprung ............................................................................................27, 101
Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung ...........................................................116
Allgemeine Inhibitionsgleichung...............................................................................116
Hyperbol (Michaelis-Menten) ...................................................................................116
Transmission............................................................................................................................9
Triethanolamin .......................................................................................................................10
trouble-shooting .....................................................................................................................99
turnover number.....................................................................................................................28
Volumenaktivität.....................................................................................................................35
Zeit-Umsatzkurven.........................................................................................................27, 100

121
Enzkin
Enzymkinetik & -mechanismus
(BB3 2006)
Bootdiskette (MS-DOS 6,20) oder:
Installieren (INSTALL\)
DOS-Programm über EN\ starten
Enzkin
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Enzymkinetik & -mechanismus
(BB3 2006)
Bootdiskette (MS-DOS 6,20) oder:
Installieren (INSTALL\)
DOS-Programm über EN\ starten