Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
3) 50 mM Na-pyruvat in (1)
4) 10 mM NADH,H + + 10 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!)
5) 0.48 M Na 2 HAsO 4 in (1)
6) 25 mM F-1,6-BP in (1)
7) Pepsin, LDH, GAPDH, TIM, Aldolase als Kristallsuspensionen.
500 µl konzentrierter Muskelextrakt werden mit 500 µl NAD + /NADH,H + -Gemisch (4) versetzt
und zur Einstellung des NAD + /NADH,H + Gleichgewichtes für 30 min temperiert (37 o ). Mit
verdünnter HCl wird sodann pH 2 eingestellt. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den
Extrakt für 30 min bei 37 o proteolytisch ab. Nach diesem Schritt stellt man pH 7.4 mit
verdünnter Ammoniaklösung ein, zentrifugiert und verwendet den Überstand zu folgenden
Analysen:
NADH,H + : 2.7 ml des Puffers (1) werden mit 5 µl LDH versetzt, damit wird das Photometer
auf E 340 =0 geeicht. Nach Zusatz von 100 µl des obigen Überstandes kann die Oxidation von
eventuell vorhandenem NADH,H + durch Zugabe von 100 µl Pyruvat (3) gestartet werden.
Man registriere den Abfall der E 340 .
NAD + : 1,7 ml der Mischung (2) werden mit 1 ml F-1,6-BP (6) und 100 µl Arsenat (5) versetzt.
Nach Zugabe von 100 µl des obigen Überstandes wird das Photometer auf E 340 = 0
gebracht. Bei Gegenwart von NAD + sollte die Zugabe der Hilfsenzyme GAPDH, TIM und
Aldolase zum Ansteigen der E 340 führen. Beim Ausbleiben einer Reaktion ist durch
Coenzym-Zugabe die Richtigkeit des Ansatzes zu überprüfen.
Bestimmen Sie den Quotienten ((NAD + )+(NADH,H + ))/((NAD + ) input + (NADH,H + ) input ), d.h.
den Anteil an Coenzym, den Sie nach der Inkubation zurückgewinnen können. Was
sagt Ihr Ergebnis aus über den Verbleib/die Stabilität dieser Coenzyme?
6.3 C2:Versuche an diversen proteinfreien Extrakten
6.3.1 C2.1 Herstellung eines Extraktes aus Kaninchenherz (zur Zeit nicht durchgeführt)
5 g Kaninchen-Herzmuskel (etwa ein halbes Herz) werden in einem Porzellanmörser mit flüssiger Luft tiefgefroren. Nach Auflegen eines
Tuches läßt sich das Gewebe zerstampfen. Man setzt einige Löffel Trockeneis sowie 50 ml 8%ige Perchlorsäure zu und verreibt die Masse
bis fast zur Homogenität (Perchlorsäure-Endkonzentration: etwa 0.6 M). Nach langsamem Auftauen steht das Gemisch für weitere 15 min
bei 0 o (gelegentlich aufrühren!). Man zentrifugiert bei 0 o für 5 min bei 10.000 Upm im SS34-Rotor. Der Überstand wird vorsichtig (!!) mit
einer Lösung aus 1 M TEA (freie Base)/6 M KOH neutralisiert, gegebenenfalls zur Klärung nochmals zentrifugiert.
6.3.2 C2.2:Deproteinierung des Skelettmuskelextraktes durch Pepsin (z.B. zu Versuch C1.4)
Analog Versuch C1.4 werden 500µl konzentrierter Kaninchen-Skelettmuskelextrakt (von Gruppe 1) im Eisbad mit 0.1 M HCl auf
pH 2 gebracht. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den Extrakt für 30 min bei ca 4 o proteolytisch ab. Danach stellt man mit verdünnter
Ammoniaklösung pH 7.4 ein. Nach Zentrifugieren weist man die Zerstörung enzymatischer Aktivitäten anhand eines robusten Enzyms nach
(z.B. über einen LDH-Test analog Versuch A1.2).