Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
Carminatti et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 7284-7288; zur Zeit nicht durchgeführt!
Alle Gruppen, die nicht D1B oder D2 durchführen
Neben PFK ist die PK, ein K + /Mg ++ -abhängiges Tetramer, das zweite hauptsächliche regulatorische Enzym in der Glycolyse. Wie
die PFK spricht es auf die Energiebilanz der Zelle an und unterliegt einer typischen 'feed-forward' Aktivierung durch F-1.6BP (warum?).
Enzyme aus vielen Organismen binden ihr Substrat, PEP, in kooperativer Weise; für das Skelettmuskelenzym wurde dies nicht
beschrieben. Erste Hinweise dafür, dass dennoch ein allosterisches Protein vorliegt, ergaben sich über die Untersuchung eines relativ
spezifischen Inhibitors, Phenylalanin (vergl. Kap. 3.5).
Substanzen
1) Testmischung 0.1 M Tris x HCl, pH 7.8
0.1 M KCl
10 mM MgCl 2
2) 5 mM Phosphoenolpyruvat (PEP) in 1)
3) 50 mM ADP in 1)
4) 150 mM Phenylalanin (Phe) in 1)
5) 4.8 mM NADH,H +
6) Enzym Pyruvatkinase; Kristallsuspension etwa 1:10 verdünnt.
Geeignete Verdünnung in 1) ausprobieren und optimieren, so dass in Abwesenheit von Phe eine gut auswertbare Kinetik erhalten wird
7) Hilfsenzym Lactatdehydrogenase (LDH) als Kristallsuspension
Pipettierplan: steigende Phe Konzentrationen
Testmisch.(1) 2690 2685 2680 2670 2640 2540 2490 2440
Pyruvat Kinase (6) 5 5 5 5 5 5 5 5
Hilfsenzym (7)
je 5 µl LDH
Phe - 5 10 20 50 150 200 250
ADP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100
NADH,H + (5) 100 100 100 100 100 100 100 100
PEP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren von 100 µl an PEP gestartet und der Abfall der E 340 wird registriert. Tragen Sie die Phe-
Konzentration gegen die relative Hemmung (0 für die Reaktion ohne Phe; maximal 1 für die vollständig gehemmte Reaktion) auf und
behandeln Sie die erhaltene Kurve als Bindungskurve des Inhibitors.
Falls sich die Kooperativität nicht deutlich zeigt, bitte deren pH-Abhängigkeit berücksichtigen. Anhand Abb. 7.4 ist zu sehen, dass der
typische kooperative (sigmoide) Verlauf nur dann deutlich wird, wenn der Bereich niedriger [Phe] Konzentration hinreichend abgedeckt ist.
Ggf. weitere Verdünnungsschritte dazunehmen.
Abb. 7.4 (nach einem
Praktikumsprotokoll): Phenylalanin ist
kooperativ bindender Inhibitor der
tetrameren Muskel-Pyruvatkinase (PK).
Auftragung der sigmoiden
Sättigungskurve in Form eines 'Hill-Plot'
einen Hillkoeffizienten n H = 1.7. Dieser
Kooperativitätsparameter ähnelt dem
Hämoglobins, das als Prototyp eines
kooperativen Proteintetramers gilt.
ein
Die
ergibt
des
- aus dieser 'Bindungskurve'lassen sich mit Hilfe des Programms Composit 'K m -Werte' [K(1) und K(2)] ermitteln, die hier
allerdings als K i -Werte zu interpretieren sind;
- wie groß sind das Verhältnis K(1)/K(2) bzw. der Hill-Koeffizient, n H , für die Bindung von Phe an PK (Programme
Composit oder MMenten)?
8 BESTIMMUNG VON K m - UND K i -WERTEN