Enzkin - Elm-Asse-Kultur

45
Km/Ki
Zur Ergänzung und falls die Zeit reicht:
- Ist dieser Versuch in der Lage, zwischen DAP, F-1,6-BP und den weiteren Vorläufern (Fructose-6-P,
Glucose-6-P) zu unterscheiden? D.h. erzielen Sie eine weitere Erniedrigung der E 340 -Ablesung, falls
Sie ca. 20 µl Portionen der genannten F-1,6-BP Vorläufer zufügen (Stammlösungen: 25 mM)?
- Ändern sich die Ergebnisse, falls Sie die EDTA-Konzentration der Testmischung von 0.36 mM EDTA
auf 5 mM EDTA heraufsetzen und falls dies zutrifft: warum?
Bitte die Aussagekraft der Versuche kritisch durchdenken! Bei allen Interpretationen
stets davon ausgehen, dass noch alle Glycolyse-Enzyme zugegen sind und aktiv sein
könnten.
6.2.4 Versuch C1.4: Lage des NAD + /NADH,H + -Gleichgewichtes im Muskel
Im Muskel wird das Gleichgewicht der Coenzyme durch zwei Enzyme, GAPDH und LDH
gesteuert:
Abb. 6.2 Gegenseitige Abhängigkeit der
GAPDH-und LDH-Reaktionen bei anaerober
Glycolyseführung.
Mit Ausnahme geringer Mengen NADH,H + , die
durch Glycerinphosphatdehydrogenase
(GDH)verbraucht werden, muss der Großteil an
NAD + durch die LDH-Reaktion regeneriert
werden.
Das Vorliegen von Triosephosphat-Vorstufen (Versuch C3) sowie von ATP (Versuch C1) im
Muskelextrakt schließt eine direkte Untersuchung des NAD + - bzw. NADH,H + -Gehaltes auf
Grund der obigen Kopplung der GAPDH- und LDH-Reaktionen aus: durch LDH oxidiertes
NAD + steht unmittelbar als GAPDH-Cosubstrat zur erneuten Reduktion zur Verfügung. Eine
weitere Komplikation besteht darin, dass NAD + sich innerhalb von Stunden im Muskelgewebe
zu einer Substanz "NADR" umsetzt, d.h. nur unmittelbar nach dem Schlachtvorgang
nachweisbar ist. Diesen Schwierigkeiten wird wie folgt Rechnung getragen:
- Ein Gemisch aus gleichen Anteilen NADH,H + und NAD + wird im Muskelextrakt bis zur
Gleichgewichtseinstellung belassen,
- das erzielte Gleichgewicht wird durch Zerstörung der beteiligten Enzyme fixiert. Für
die jeweilige Analyse wird dann nur die benötigte Aktivität zugesetzt.
Substanzen:
1) LDH-Puffer aus A1.1 (0.03 M Na-phosphat, pH 7.4)
2) Aldolase/GAPDH-Puffer aus A3