Enzkin - Elm-Asse-Kultur

31
Aktivitätstests
(Endkonzentration 0.16 mM NADH,H + , d.h. E 340 = 1). Man starte die Reaktion durch
Zugabe von 100 µl ATP-Lösung und registriere den Abfall der E 340 . Aus der
Anfangsgeschwindigkeit dieser Reaktion errechne man die Volumenaktivität sowie die
spezifische Aktivität. (Siehe das Rechenbeispiel in Kapitel 4.10).
4.5 Versuch A3: Kombinierter Test für Aldolase und GAPDH
Der optische Test der Aldolase setzt die Verfügbarkeit zweier Hilfsenzyme, TIM und
GAPDH voraus; er arbeitet auch in Gegenwart von nur GAPDH, basiert dann aber nur
auf der Umsetzung des Nebenproduktes der Aldolspaltung, GAP.
Substanzen:
1) Testmischung: 5 mM Dithiothreitol (DTT)
0.36 mM EDTA
65 mM Tris-HCl, pH 7.4
2) 0.48 M Na 2 HAsO 4
3) 30 mM NAD +
4) 25 mM F-1,6-BP
5) ggf. Hilfsenzyme 6) (je 5 µl Kristallsuspension).
Man versetze 1.7 ml der Testmischung nacheinander mit 1 ml F-1,6-BP (4), 100 µl
glycolytischer Lösung und 100 µl Na 2 HAsO 4 (2). Das Photometer wird mit dieser
Mischung auf E 340 =0 geeicht. Durch Zugabe von 100 µl NAD + (3) kann die
enzymatische Reaktion gestartet und durch Messung der E 340 verfolgt werden.
Auswertung wie zuvor.
4.6 Versuch A4:Aktivitätstest für Aldolase (Hydrazonbildung, zur Zeit nicht durchgeführt)
Falls ein "UV-fähiges" Photometer zugänglich ist: Ein Testverfahren, das unabhängig von Hilfsenzymen ist, beruht darauf, dass
GAP und DAP, die Produkte der enzymatischen Reaktion, mit Hydrazin (vergl. Fußnote 5 ) zu den entsprechenden Hydrazonen
umgesetzt werden können. Dieser Folgeschritt verschiebt das Gleichgewicht der enzymatischen Reaktion ganz auf die Seite der
Triosephosphate:
Die Entstehung des GAP-Hydrazons kann dabei durch seine Lichtabsorption bei 240 nm verfolgt werden.
Eine Einheit enzymatischer Aktivität ist hier willkürlich definiert als eine Extinktionsänderung ∆E 240 = 1 je min. Welche Angabe
wäre erforderlich, um die Aktivität nach internationaler Vereinbarung in (µmol GAP/min . mg Aldolase) darstellen zu können?
Substanzen:
1) Substrat: 25 mM Fructose-1,6-diphosphat in H 2 O, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung)
2) Reagenz: 3.5 mM Hydrazin-Sulfat in 0.1 mM EDTA, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung).
Man fülle eine QS-Küvette nacheinander mit 500 µl Substrat (1), 2 ml Reagens (2) und 500 µl H 2 O, eiche mit dieser Mischung