Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Arbeitshinweis
A - Küvetten-Verfahren
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA bzw. Lysozym (analog Kapitel 1.2.2).
Hierfür werden die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 200fach verdünnt (Endkonzentrationen
5-50 µg/ml). In Plastik-Küvetten werden 100 µl der Lösungen mit
1.9 ml des Protein-Reagens versetzt. Nach gründlicher Durchmischung (Vortex!)
stehen die Proben 30 min, bevor sie gegen einen 'blank' (aus 100 µl Puffer plus 1.9
ml Protein-Reagens) bei 595 nm vermessen werden. Der Muskelextrakt wird wie die
Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswerten verglichen.
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Bei Anwendung des Verfahrens bitte den
ungewöhnlichen Farbwert des gängigen Eichproteins BSA beachten (vergl. 1.2.6). Lysozym wäre
eine bessere Wahl.
B - ELISA-Reader
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Nach Zugabe von 100 µl
Bradfordlösung in jedes Loch können die Proben nach 2 min im ELISA-Reader bei
595 nm vermessen werden. Aus den gemessenen Eichwerten läßt sich eine
Eichgerade erstellen (zumeist bis 1.5 Extinktionseinheiten linear) und damit lässt sich
der Proteingehalt der Proben direkt ermitteln.
Bitte auch Ausführungen zur Eichgerade unter A beachten.