Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
5) 4.8 mM NADH,H +
6) Hilfsenzym Glycerin-3-P-Dehydrogenase (5 µl GDH-Kristallsuspension; da PFK das "
Flaschenhalsenzym" der Glycolyse darstellt, sind bei Verwendung des Muskelextraktes
Trisosephosphat-Isomerase und Aldolase als weitere Hilfsenzyme entbehrlich)
7) 100 µl Muskelextrakt als Quelle für Phosphofructokinase
Solange gereinigte Phosphofructokinase erhältlich war (bis 1997) wurden 10-50 µl Kristallsuspension auf 1 ml H 2 O verwendet.
Die Lösung wurde auf 20 mM DTT eingestellt (20 µl einer 1M Lösung von DTT ad 1 ml) 17 . Stabilitätsprobleme werden durch
Verwendung des vollständigen Muskelextraktes umgangen (warum?). Allerdings ist der Extrakt vor Versuchsbeginn von
"störenden" Metaboliten (insbesondere ATP) zu befreien (warum?).
A) Einfluss der ATP-Konzentration 18
Depletieren des Muskelextraktes(ATP): Aufgrund der Versuchsgruppe B ist bekannt, dass
der Muskelextrakt bereits ATP, aber auch Glucose, G-6P, DAP und 3-PG enthält. Bei Zusatz
von GDH und NADH,H + können 3-PG und DAP über den Schritt 3 (Kap. 2.1) in der GDH
Reaktion abgezogen werden; dabei sollte auch ATP umgesetzt werden (Glucokinase-, PFK-
Reaktionen aber auch PGK-"Rückwärtsreaktion"). Verglichen mit dem zugesetzten
Hilfsenzym (GDH) sollte die Wirkung endogener LDH von untergeordneter Bedeutung sein,
damit Neusynthese des ATP zu vernachlässigen sein. Bei Vorversuchen wurde gezeigt,
dass die Depletierung im Pipettierschema beim F-6P-Schritt gelungen ist (Abb. 7.3): Die
Reaktion wird erst durch Zugabe externen ATPs (und nicht schon bei Zugabe von F-6P)
gestartet. Die spezifische PFK-Reaktion verrät sich aufgrund des sich charakteristisch
beschleunigenden Umsatzes (Abbau inhibitorischer ATP-Konzentrationen, Entstehung von
stimulatorischem F-1.6BP, das in der Küvette die Rolle von F-2.6BP übernehmen kann):
Pipettierplan:
Testmischung (1) 2625 2595 2545 2445
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100
NADH,H + (5) 150 150 150 150
- Warten: Depletion -
F-6P (4) 100 100 100 100
- Extinktion stabil? -
ATP (2) 20 50 100 200
17 Phosphofructokinase wird zwischen pH 7 und 8 extrem instabil; nur in Gegenwart von
Substraten/Substratanalogen (2 mM ATP, 10mM Phosphat) bleibt sie bei pH 7 für >10 Minuten unverändert;
andernfalls wird sie innerhalb von 2 Minuten inaktiviert. J. V. Passoneau & O. Lowry (1962) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 7, 10-14.
18 K. Uyeda & E. Racker (1965), J. Biol. Chem. 240 4682-4688, Fig. 4