Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Tricks
8.14.2 Ping-pong bi-bi Mechanismus
Hier wird bereits ein Produkt nach Bindung des ersten Substratmoleküls freigesetzt („Ping“). E geht
dabei in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat bei Bildung des zweiten
Produktes reagiert („Pong“). E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphat-Komplex, der mit einer
Aminosäure reagiert, F ein Transaminase-Pyridoxamin-Komplex, der eine Ketosäure umsetzt.
Die Lineweaver-Burk Auftragung zeigt für diesen Fall die Charakteristika einer unkompetitiven
Inhibition: die katalytische Effizienz (Kap. 8.2; hier: Steigung, bzw. Quotient V max/ K m )
bleibt konstant. Hilfsvorstellung: dies ist eine Folge der Tatsache, dass der erste Substratumschlag
bereits in Abwesenheit des zweiten Substrates erfolgt, so dass die Tangente an den Ursprung einer
MMenten-Funktion ihre Steigung nicht ändert (Abb. 8.2.1).
Abb. 8.14: Verhältnisse beim Ping-pong bi-bi Mechanismus. Ein Produkt wird bereits nach Bindung
des ersten Substratmoleküls freigesetzt.
E geht in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat unter Bildung des zweiten Produktes
reagiert. E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphatkomplex, der mit einer Aminosäure reagiert, F ein
Transaminase-Pyridoxaminkomplex, der eine alpha-Ketosäure umsetzt.
TRICKS UND ' trouble-shooting'
9.1 Funktioniert das Photometer?
(Auszug aus "Boehringer Mannheim GmbH: Testfibel")
Prüfung: ca. 500 mg Kaliumhexacyanoferrat-(III) in 500 ml aqua dest. lösen (E =1). Mit aqua 1+1, 1+3
und 1+9 Verdünnungen herstellen und die vier Lösungen bei 355 nm gegen Wasser messen; die
Chemikalie weist hier ein Extinktionsminimum nahe der sonst meist verwendeten Wellenlänge von
340 nm auf. Messungen in Minima oder (vorzugsweise) Maxima sind verlässlicher als solche an der
Flanke einer Absorptionsbande. Die abgelesenen Extinktionswerte müssen sich wie 1:0.5 bzw. 1:0.25
und 1:0.1 verhalten, dann spricht das Photometer linear auf Konzentrationen (Extinktionen) an.
Die Absolutwerte der drei Lösungen sollten 1, 0.5, 0.25 und 0.1 betragen und
können zum Vergleich verschiedener Photometer untereinander verwendet werden.
9.2 Optimierung der Versuchsbedingungen bei schlecht auswertbaren
Kinetiken
Anfangssteigungen sind nicht ablesbar, weil
- die Reaktion zu schnell abläuft: Enzymkonzentration senken,
- die Reaktion zu langsam verläuft: Enzymkonzentration anheben.
falls der erwartete Endpunkt nicht erreicht wird: eines der Cosubstrate limitiert
die Reaktion,
- der Reaktionsverlauf keinen linearen Anfangsbereich aufweist: Kon-