Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Tricks
10. ZUR BEDEUTUNG VON CYSTEINEN FÜR ENZYMATISCHE AKTIVITÄTEN
(REAKTIONSKINETIK)
Literatur: Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day Inc. (1964), S. 155
Abb. 10.1: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (NBS 2 bzw. "Ellman's Reagens”) reagiert mit freien,
deprotonierten Sulfhydrylgruppen, z.B. aus Proteinen. Für jede abreagierte Thiolgruppe wird wird ein
Thionitrobenzoat-Anion frei. Das stark gelb gefärbte Anion kann aufgrund seiner Extinktion bei 412 nm
quantifiziert werden (ε 412 = 1.36x10 4 bei pH 8). NBS 2 wird auch als reversibel modifizierendes Reagens für die
Modifikation von Proteinen benutzt. Behandlung des Phosphorylase b-Dimers ergab z.B. Thiolgruppen zweier
Reaktivitäten. Darunter hatten zwei hochreaktive Reste keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität, die jedoch
parallel zu einer Gruppe wenig reaktiver Thiole abnahm (Damjanovich und Kleppe, Biochim. Biophys. Acta 122,
145, 1966).
Sulfhydrylgruppen können, oberhalb ihres pK a -Wertes, spezifisch durch SH-SS-
Austausch mit Disulfid-Reagenzien modifiziert (oxidiert) werden. Durchführung in
8 M Harnstoff (d.h. unter denaturierenden Bedingungen im leicht alkalischen Milieu)
ermöglicht die colorimetrische Erfassung aller Cysteine eines Proteins, während im
nativen Zustand nur die exponierten bzw. aktivierten SH-Funktionen nachweisbar
sind
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Die folgenden Versuche dienen dazu, den Gesamtgehalt von
Dehydrogenasen an Cysteinen sowie die Zahl der reaktiven bzw. an der Katalyse
beteiligten Cysteinreste zu bestimmen.
10.1 Zur Auswertung von Kinetiken für Reaktionen zweiter Ordnung
Für eine Reaktion zweiter Ordnung vom Typ
44 Anstelle eines chromogenen Substrates kann in einem solchen Ansatz auch ein fluorogenes
Substrat wie BIPM ([p-(2-benzimidazoly)phenyl]maleimid) eingesetzt werden.. Dabei ergibt sich ein
erheblicher Empfindlichkeitsgewinn, vergl. J. Bode & K. Wagner (1980) Cooperative exposure of
histone H3 thiols in core particles. Int. J. Biol. Macromol. 2, 129-136.