Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
Spezies Luciferase Luciferin Emissions-Wellenl./ Art
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Bakterien M r 80k FMNH 2 +RCHO 495nm/kontinuierl.
Dinoflagell. M r 420k Polypyrrol 465nm/Blitz
Coelentrate M r 21k Colenterazine 460nm/ "
Photinus M r 100k Benzthiazole 560nm/ "
Die Luciferine verschiedener Spezies variieren grundlegend. Entsprechend gibt es verschiedene Luciferasen,
die als Peroxidasen, Mono- oder Dioxigenasen arbeiten können. Die verschiedenen mechanistischen
Gegebenheiten ermöglichten eine Fülle neuer analytischer Verfahren zum Nachweis von Energieträgern (ATP,
NADH,H + , FMNH 2 ), Kationen (Mg ++ , Ca ++ , Sr ++ ) und (aufgrund ihres ATP-Gehaltes) zu Bakterienzähllungen:
Spezies
Reaktionsbedingungen
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Bakterien NADH,H + und FMNH 2
Photinus (Leuchtkäfer)
und Renilla (Federkoralle) ATP, Mg ++
Aequora (Qualle) Photoprotein, Ca ++ , Sr ++
Cypridina (Muschelkrebs) -
In diesem Praktikum soll der Nachweis von ATP und ATP-Vorstufen durch Biolumineszenz
demonstriert werden. Vor Aufkommen der Luminometer konnten hierfür mit einigem Erfolg
die für Radiolumineszenzmessungen entwickelten Szintillationszähler eingesetzt werden, da
beide Methoden auf der Zählung von Lichtblitzen je Zeitintervall beruhen. Es wird gezeigt,
dass für diesen Test rohe Leuchtkäfer-Extrakte eingesetzt werden können, da diese sowohl
Luciferase als auch Luciferin (leider auch einiges an ATP) mitbringen.
6.5 Biolumineszenzmessungen mit einem Luminometer 12
6.5.1 Versuch C3.0:Luciferin/Luciferasepräparat
Puffer:
25 mM Glycylglycin (pH 7.8 mit 0.1 M KOH)
15 mM MgSO 4
Luciferin/Luciferasereagens:
50 mg getrocknete Leuchtorgane (Sigma FFT, Firefly Lantern, desiccated tails, 500 mg DM 46,92 oder Sigma
FFW, desiccated whole Fireflies, 5 g DM 85,--) werden mit Hilfe eines 15 ml Potter-Homogenisators und 5 ml
eiskaltem 0.1 M Arsenat für mindestens 5 min sorgfältig homogenisiert und in Intervallen gevortext. Das
Homogenat wird dann zur teilweisen Klärung zentrifugiert (8000 xg, 3 min). Die Überstände füllt man mit 0.1 M
Arsenat auf 50 ml auf und setzt 500 mg MgSO 4 x 7 H 2 O zu. Bei 4 o hält sich diese Lösung für mehrere Tage.
Achtung: Mit der Zugabe von MgSO 4 wird die Luciferin-Luciferasereaktion gestartet, d.h., endogenes ATP
verbraucht. Die Lösung sollte nicht unmittelbar verwendet werden, da sonst sehr hohe Blindwerte resultieren
können.
6.5.2 Versuch C3.1:Eichreihe für ATP
Daten für ATP: M r = 507.2; ε 259 = 15 400; Verdünnungslösung: 5 mM MgCl 2 in Wasser.
12 Zu diesem Versuch gibt es eine Vorläufer-Vorschrift, die auf den Gebrauch (die 'Zweckentfemdung') eines
Szintillationszählers zugeschnitten war. Derzeit sind wir auf solchen Behelf nicht angewiesen.