Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Tricks
8.13 Versuch E4: Berechnung von Inhibitionskonstanten aus optimierten
Datenreihen
Unter C\EN sind auf der Festplatte Datenreihen mit den Nummern IX31-IXnm zu
Demonstrations bzw. Übungszwecken abgespeichert. Jede Gruppe sollte einen
(oder mehrere) dieser 'files' auswerten, z.B. Gruppe 1 die Datenreihe IX31, Gruppe 2
IX32 etc..
8.14 BESONDERHEITEN BEI MEHRSUBSTRATREAKTIONEN
Bisswanger (1994) "Enzymkinetik", pp 138; Voet und Voet (1992) "Biochemie", pp342;
http://de.wikipedia.com/Mehrsubstratreaktion
Die Michaelis-Menten Beziehung und einige ihrer Erweiterungen bezogen sich
ursprünglich nur auf Einsubstrat-Umsetzungen. In der Realität arbeiten typische
Enzyme mit zwei oder mehreren Co-Substraten (LDH mit NADH,H + und Pyruvat).
Die Formalismen in ihrer einfachen Form erweisen sich auch für diese Erweiterung
solange als gültig, wie man die Konzentrationsabhängigkeit nur eines Substrates
untersucht und die anderer Substrate in sättigenden Mengen vorlegt. Damit erhält
man die kinetischen Konstanten des variierten Substrats, nicht jedoch Informationen
über den Mehrsubstrat-Mechanismus (welche eine gegenseitige Variation aller
beteiligten Substrate erfordert).
Eine eingehende Beschreibung von Mehrsubstrat-Reaktionen geht auf W.
Wallace Cleland (1963) zurück.
In der Nomenklatur nach Cleland bezeichnet man Substrate in der Reihenfolge ihrer Bindung mit
A,B,C, die Produkte in der Reihenfolge ihrer Ablösung als P,Q,R. Das Enzym bildet mit Substraten
bzw. Produkten 'transitory complexes' der Form EA, EP, etc. Die Zahl der Substrate, die insgesamt
an der Hinreaktion und die der Produkte, die an der Rückreaktion teilnehmen, wird durch uni-/bi-/teretc.
benannt. LDH würde somit einem 'sequential-bi-bi' Mechanismus folgen, während
Transaminasen bzw. FAD-abhängige Dehydrogenasen (deren Coenzym durch ein Folgesubstrat zu
regenerieren ist) einem 'ping-pong-bi-bi' Mechanismus gehorchen.
Führt man enzymkinetische Messreihen, jeweils in Gegenwart einer
nichtsättigenden, aber konstanten Konzentration von A (NADH,H + ), bei steigenden
Konzentrationen von B (Pyruvat) durch, so entsteht im Lineweaver-Burk Diagramm
das Muster einer ḿixed typé Inhibition (Abb.8.14 zeigt den Idealfall eines
nichtkompetitiven Musters). Auswertung der Primärbindungsdaten (hier: drei
Hyperbeln) durch nichtlineare Regression kann im Programm DNRPeasy durch
Anpassung an die erweiterte Michaelis-Menten Gleichung für
Zweisubstratreaktionen vorgenommen Werten:
v =
Vmax[ A][ B]
K K + K [ B] + [ A][ B]
iA mB mA
Daraus resultieren K m Werte für beide Substrate, sowie ein Wert "K iA".. K iA
kennzeichnet die Bindung des Substrates A an das freie Enzym, d.h. für die Bildung
eines katalytisch noch nicht aktiven Übergangskomplexes; der Wert ist identisch mit
der Inhibitionskonstanten, die A als Produktinhibitor bei der Rückreaktion hätte.
Analoge Informationen entnahm man früher Sekundärauftragungen der ślopeś bzw.
ínterceptś des Lineweaver-Burk Diagramms (Abb. 8.14) und handelte sich damit alle
Nachteile dieses Verfahrens ein (Abb. 8.5.).