Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Arbeitshinweis
Reduktion des Reagens. Die Lösung muss beim Auftreten roter oder schwarzer Präzipitate verworfen werden.
Eichreihe (allgemeine Vorschrift):
140 mg BSA oder Eiweiß-Lysozym einwiegen und in 5 ml H 2 O (bzw. Probenpuffer)
lösen. Auffüllen auf 10 ml. Extinktion einer 1:10 Verdünnung messen.
Sollwerte für 1 mg/ml
BSA: E 280 = 0.66
Lysozym: E 281,5 = 2.64
V o ml der Stammlösung durch Verdünnen (d.h. Zugabe von
BSA:
Lysozym:
∆v = V o (E 280 /0.66) - V o bzw.
∆v = V o (E 281,5 /2,64) - V o
ml) auf 10 mg/ml einstellen. Verdünnungsreihe ansetzen:
1)100 µl Stammlösung + 900 µl Puffer : 1mg/ml (Sollwert)
2) 200 µl " + 800 µl " : 2mg/ml
...
...
...
9) 900 µl " + 100 µl " : 9mg/ml
10)Stammlösung:
10mg/ml
Durchführung:
In Plastik-Küvetten werden 400 µl Proben (mit 1-10 mg BSA/ml) mit 1.6 ml Biuret Reagens versetzt. Die Proben stehen nach
guter Durchmischung für 30 min bei Raumtemperatur. Analog verfährt man mit 400 µl einer adäquaten Verdünnung des
Muskelextraktes. Eine Blindprobe enthält 400 µl H 2 O (bzw. Probenpuffer) und 1.6 ml Biuret Reagens.
Man misst die Extinktion aller Proben bei 550 nm und konstruiert eine Eichkurve, aus der dann die Konzentration der
unbekannten Proben abgeleitet wird.
Für die Auswertung sollten nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden. Nur in diesem Fall ist eine
Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline");
"Bestline" führt eine Standard-lineare- Regressionsanalyse durch; der zwangsläufige Ursprung [0,0] wird nicht
berücksichtigt. Soll die Regressionsgerade durch den Nullpunkt verlaufen, so kann das Polynom nach Kap. 9.2.2, d.h.
eine Funktion des Programms "Composit" eingesetzt werden. Eine Ursprungsgerade folgt, wenn a o , a 2 und a 3 gleich
1E-27 gesetzt und maskiert werden. Betreuer fragen!).
1.2.3 Methode nach Lowry (Zur Zeit nicht durchgeführt)
J. Biol. Chem. 193, 265 (1951); Meth. Enzymol. III, 448
Die nach Lowry modifizierte Folin-Methode hat gegenüber einer Extinktionsmessung bei 280 nm den Vorteil einer 10-
20fach höheren Empfindlichkeit; sie ist 100x so empfindlich wie die Biuret-Methode. Aber: Das Verfahren kann in Abhängigkeit
vom Protein zu unterschiedlichen Farbwerten führen, und die erzielte Farbe ist nicht immer direkt proportional der Proteinkonzentration.
Die Farbentwicklung beruht auf
- der Biuret-Reaktion von Peptiden mit Cu ++ im alkalischen Milieu
- der Reduktion von Phosphomolybdän/Phosphowolframsäure durch Tyrosin- und Tryptophanreste des Proteins.
Reagenzien:
Folin-Ciocalteau-Reagens (kommerziell erhältlich).
(Der Herstellungsgang für sparsame Naturen:
Eine Mischung aus 100 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 25 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 50 ml 85 % H 3 PO 4 , 100 ml konz. Salzsäure und 700 ml H 2 O
werden für 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Die Mischung wird mit 150 g Li 2 SO 4 , 50 ml H 2 O und einigen Tropfen wässriger Br 2 -
Lösung versetzt, für 15 min nochmals ohne Kühler zum Sieden erhitzt und gekühlt. Nach Auffüllen auf 1 Liter wird filtriert. Falls
das Produkt eine grünliche Farbe hat, ist es unbrauchbar, die Prozedur ist zu wiederholen!!).
1) 2 % Na 2 CO 3 in 0.1 M NaOH