Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Arbeitshinweis
zu minimieren.
Messungen erfolgen bei Raumtemperatur im Photometer bei 562 nm. Ein
Blindwert (proteinfreie Probe) ist von den Messungen abzuziehen. Der Muskelextrakt
wird wie die Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswert verglichen.
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Es ist strikt darauf zu achten, dass die auszuwertenden
Proteinlösungen frei sind von Reduktionsmitteln (2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol,
reduzierende Zucker; siehe Prinzip der Farbentwicklung). Chelatoren (EDTA) sind beim Ansatz der
Eichreihe zu berücksichtigen. Keine Störung durch nichtionische Detergenzien sowie die gängigen
Puffersubstanzen.
B -
ELISA-Reader (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Die Platte wird bei 60 o für
30 min inkubiert und dann im ELISA-Reader bei 562 nm ausgewertet. Zur Linearität
der Eichkurve und zur Auswertung: siehe unter A.
Eigentliche ELISA-Tests gehören zu Standardverfahren der Immunologie. Z.B. wird ein
(nachzuweisendes) Antigen an die Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden. Zugabe eines
spezifischen (ersten) Antikörpers schafft einen stationären Antigen-Antikörperkomplex. Der erste
Antikörper wird über eine ubiquitäre Sequenz (z.B. am F c -Teil) durch einen (käuflichen) zweiten
(Fusions-)Antikörper erkannt. Dieser zweite Antikörper wurde mit einem Enzym (z.B. alkalischer
Phosphatase) gekoppelt, das ein chromogenes Substrat zum Farbstoff umsetzt. Auftreten des
Farbstoffes läßt also auf Gegenwart des Antigens schließen. Im Praktikum wird die Tatsache genutzt,
dass jeder ELISA-Reader im Prinzip ein Photometer und eine bequeme Registriereinheit beinhaltet.
Allerdings wird nicht kontinuierlich, sondern in Intervallen registriert (was ist zu beachten?)
1.2.4 Fluram (Flurescamin)-Methode (Zur Zeit nicht durchgeführt)
J. Bode (1979) On the reactions of Fluorescamine with chromosomal proteins. Anal. Biochem. 99, 274-280
Prinzip: Fluorescamin, ein nichtfluoreszierendes Furanon, hat die
Eigenschaft, mit Protein-Aminogruppen zu einem fluoreszierenden
Pyrrolinon zu reagieren. Diese Reaktion hat eine Halbwertszeit von
500 ms; überschüssiges Reagenz wird in wässriger Lösung durch
Hydrolyse des Lactons in wenigen Sekunden "desaktiviert".
Abb. 1.3: Fluorescamin-Reaktion
Substanzen:
1) Fluorescamin-Lösung:
mg "Fluram" (Roche) gelöst in 100 ml trockenem Aceton