Enzkin - Elm-Asse-Kultur
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Km/Ki<br />
6.3.3 C2.3:Metabolitengemisch unbekannter Herkunft und Zusammensetzung<br />
Wir geben Ihnen eine proteinfreie Metabolitenlösung, deren Herkunft und damit Zusammensetzung nur uns<br />
bekannt ist.<br />
6.3.4 Versuch C2.4.1:Energiereiche Phosphate: ATP<br />
Abb. 6.3: Analyseschema "energiereiche Phosphate": ATP und Creatinphosphat.<br />
CP, Creatin-phosphat; CPK, Creatin-phosphokinase<br />
Prinzip:<br />
Puffer:<br />
0.1 M TEA (freie Base), pH 7.6 (mit HCl)<br />
10 mM MgCl 2<br />
2 mM EDTA<br />
2.5 mM Hydrazin (kein Hydrazinsulfat!)<br />
Hilfsenzyme:<br />
PGK und GAPDH<br />
als gemischte Kristallsuspension oder Extrakt<br />
Creatinphosphokinase (CPK)<br />
30 mg in 1 ml H 2 O gelöst<br />
2.7 ml Puffer werden mit 5 µl Hilfsenzymen sowie 100 µl (optimieren!!) des zu<br />
analysierenden Extraktes versetzt. Nach Eichen des Photometers auf E 340 = 0 setzt man 100<br />
µl 4.8 mM NADH,H + (aus A1) zu. Dann startet man die Reaktion durch 100 µl 360 mM 3-PG.<br />
Falls NADH,H + die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der<br />
ATP-Konzentration.
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