Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Aktivitätstests
Aktivität sind dann die Enzymeinheiten je Masseneinheit [mg] an Protein; dies ist gleichzeitig
ein nützliches Reinheitskriterium, welches hilft, den Fortgang von Reinigungsoperationen zu
beurteilen. ́τ́, die ́ turnover numbeŕ (auch " Wechselzahl", " molare Aktivität" oder kcat)
bezeichnet die Zahl der Substratmoleküle, die je Zeiteinheit (zumeist: Sekunde) von einem
Enzymmolekül umgeschlagen wird. Die turnover number von Enzymen kann über viele
Größenordnungen schwanken; das aktivste bisher beschriebene Enzym ist Carbonsäureanhydratase
(100 000 Substratmoleküle je Sekunde; 10 7 fach beschleunigt gegenüber
der unkatalysierten Reaktion).
4.2 Versuch A0: Präparation des Muskelextraktes
5 g gefrorener Kaninchenmuskel werden im Virtis-Homogenisator in
1) 100 ml EDTA (50 mM) pH 8.4 (mit NaOH)
zerkleinert. Man zentrifugiert das Homogenat (SS34 Rotor, 10000 Upm, 5 min), bestimmt den
Proteingehalt des Überstandes nach einem geeigneten Verfahren (Kapitel 1.2), verdünnt ihn
mit 1) im Verhältnis 1:10 und führt an dieser Lösung die Enzymtests A1.1-A7.3 durch. Dabei
sind sowohl die Gesamtaktivitäten einer Reaktionskette (Aldolase-TIM-GAPDH bzw. PGK-
GAPDH) zu messen als auch die Einzelaktivitäten durch Zusatz geeigneter Hilfsenzyme (vgl.
Kapitel 2.1). Durch einen Vergleich der Volumenaktivitäten soll bei gekoppelten Tests jenes
Enzym ermittelt werden, welches die jeweilige Reaktionskette limitiert.
4.3 Versuch A1.1: Aktivitätstest für Lactat-Dehydrogenase: "Vorwärtsreaktion" 4
Obgleich dieses Enzym nach seiner Fähigkeit benannt worden ist, Milchsäure zu
Brenztraubensäure (pyruvic acid) zu oxidieren, ist beim glycolytischen Enzym das
Gleichgewicht so sehr in Richtung der Milchsäurebildung verschoben, dass die Mehrzahl der
Testverfahren auf diesem Vorgang beruhen. Dies ist die zweite Stelle im Glycolyse-Schema,
an dem mit Vorteil der optische Test angewendet werden kann (d.h., Registrierung des mit
der NADH, H + -Umsetzung verbundenen Abfalls der E 340 ).
Substanzen:
1) Puffer:0.03 M Na-phosphat, pH 7.4
(hergestellt durch Mischen von 0,03 M NaH 2 PO 4 und 0.03 M Na 2 HPO 4 oder durch NaOH-Titration von
einer konzentrierteren NaH 2 PO 4 -Lösung, die dann auf ihr Endvolumen gebracht wird)
2) 50 mM Na-pyruvat
3) 4.8 mM NADH
4 Als "Vorwärtsreaktion wird in diesem Praktikum die Reaktionsrichtung in der Glycolyse definiert.
Schreibergeschwindigkeit für alle Kinetiken: 60 mm/min d.h. 1 mm/s (geräteabhängiger
Richtwert)