Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Aktivitätstests
Absinken der E 340 beschleunigen und ist (nach eventueller Korrektur) ein Maß der
TIM-Aktivität.
4.9.1 A7.1: Darstellung des GAPDH-Substrates (GAP)
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe. Wird durch die Assistenten erledigt.
Prinzip: Es soll aus einer chemisch stabilen Vorstufe, dem Bariumsalz der D,L-Glycerinadehyd-3-Phosphorsäure (GAP-R) das
instabile Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) gebildet werden. Austausch der Ba 2+ -Ionen und Zerlegung des (säurelabilen) Acetals
erfolgen in einem Schritt an einem Kationenaustauscher (Dowex-50 W-Harz).
Substanzen: 1) Dowex-50-Ionenaustauscher (H + -Form); 2) D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat-diäthylacetal, Ba ++ -Salz (GAP-R).
In einem Zentrifugierglas werden 7,5 g Dowex-Harz und 500 mg GAP-R in 25 ml H 2 O suspendiert. Unter ständigem Schütteln
wird die Suspension 3.0 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt, wobei GAP in Lösung geht. Man kühlt das Gemisch im
Eisbad, zentrifugiert und entfernt GAP vom Harz durch Dekantieren. Um eine möglichst vollständige Extraktion des GAP aus dem
Harz zu erreichen, wird letzteres mindestens noch einmal in je 2 ml H 2 O suspendiert und zentrifugiert. Die Überstände werden
vereinigt.
Wird diese Vorschrift genauestens eingehalten, so enthalten die vereinigten Überstände mindestens 150 µmol D,L-GAP (d.h., 75
µmol des natürlichen, D-konfigurierten) Isomers. Die Lösung ist für mindestens vier Tage völlig stabil; Gefrieren erhöht die
Lebensdauer beträchtlich und wird empfohlen.
4.9.2 Versuch A7.2: Standardisierung der GAP-Lösung (enzymatisch)
Prinzip:
Erfaßt wird nur das D-Isomer des GAP. Näheres zum optischen Test unter 2.4.
Substanzen:
1) 0.2 M Tris-HCl, pH 8.5
2) 0.17 M Na 2 HAsO 4
3) 0.2 M L-Cystein
4) 0.6 M NaF
5) 0.02 M NAD +
6) GAPDH-Lösung mit 750 µg Protein je ml (einstellen gemäß Kapitel 1.2.1)
In eine Küvette pipettiert man: 1.5 ml Tris-HCl Puffer, 300 µl Na 2 HAsO 4 , 300 µl H 2 O,
50 µl Cystein, 600 µl NaF, 100 µl GAPDH und 100 µl GAP. Man schreibt die Nullinie
und startet die Reaktion durch Zugabe von 50 µl NAD + . Endvolumen: 3ml.
Achtung: durch erhebliche Instabilität von verdünntem GAP ist es erforderlich, die Reaktion bald nach
GAP-Zugabe zu starten.
Kalkulation: E 340 x 3/6.3 = µmol GAP in Küvette 1, d.h., in 100 µl der zu
standardisierenden GAP-Lösung. 7
7 Die Richtigkeit dieses Ansatzes folgt am einfachsten aus folgenden Überlegungen: