Enzkin - Elm-Asse-Kultur
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Km/Ki<br />
1 mg ATP wird in 5 ml Verdünnungslösung aufgenommen und mit wenigen Tropfen<br />
0.1 M NaHCO 3 neutralisiert; die Konzentration wird durch Extinktionsmessung bei 259 nm<br />
bestimmt (E 259 für diese Lösung: ca. 5; zu überprüfen an einer 1:10 Verdünnung). Durch<br />
weiteres Verdünnen wird hieraus eine 0.4 µM ATP-Stammlösung hergestellt (endgültiger<br />
Verdünnungsfaktor etwa 1000).<br />
Eichreihe:<br />
ATP-Stammlösung (µl)<br />
Verdünnungslösung (µl)<br />
10 990(1)<br />
20 980(2)<br />
30 970(3)<br />
...<br />
...<br />
100 900(10)<br />
Diese Lösungen sind im Gerät vorzulegen. Luciferin/Luciferasereagenz wird auf Knopfdruck<br />
injiziert; die Zahle der Lichtblitze wird im Verlauf von 10 s automatisch summiert und<br />
angezeigt (Integralmessung).<br />
- Welches ist die Messgrenze des hier beschriebenen Verfahrens, d.h., welche<br />
Menge (in g) an ATP liefert noch eine Ablesung, welche um den Faktor 10 über<br />
dem Blindwert liegt?<br />
- Liefern die obigen Ablesungen eine Eichgerade? Erklären Sie eventuelle<br />
Abweichungen.<br />
6.5.3 Versuch C3.2: Energiereiche Phosphate: ATP und Creatin-Phosphat<br />
Zur Analyse steht nach Kapitel 6.3.3 (Versuchsnummer C2.3) ein Metabolitengemisch mit<br />
ATP und Creatinphosphat im millimolaren Bereich zur Verfügung. Beide energiereichen<br />
Phosphate sollen quantifiziert werden, wofür die folgenden prinzipiellen Möglichkeiten<br />
denkbar sind:<br />
a - Sequenzielle Messung von ATP und CP. Bestimmung von ATP wie unter 6.5.2. Nach Ablauf der Luciferasereaktion (überprüfen!)<br />
Creatinphosphat mit Hilfe der CPK-Reaktion (C2.4.2) zu ATP umsetzen. Quantifizierung des so generierten ATP durch erneutes Starten<br />
der Luciferase/Luciferinreaktion.<br />
b - Parallele Bestimmung von ATP und Creatinphosphat. Im Falle des CP-Ansatzes wird zunächst freies ATP mit Hilfe der stark<br />
exergonen Hexokinasereaktion abgebaut. Nach Inaktivierung der Hexokinase wird ATP über die CPK-Reaktion (C2.4.2) aus CP generiert<br />
und dann wie oben vermessen.<br />
Substanzen: 10x TEA-Puffer pH 7.6<br />
0.5 M Triethanolamin-hydrochlorid, eingestellt mit NaOH<br />
10x Magnesiumchlorid<br />
0.1 M MgCl 2<br />
10x Glucose<br />
0.5 M Glucose<br />
Hexokinase: Kristallsuspension<br />
3.5 ml des Gemisches mit je 500 µl 10x TEA, 10x Magnesiumchlorid und 10x Glucose versetzen. 3µl Hexokinasesuspension zusetzen und<br />
Ansatz für 30 min bei Raumtemperatur belassen. Abwesenheit des ATP überprüfen, dann Enzymaktivitäten durch Erhitzen (5 min im<br />
kochenden Wasserbad) zerstören. Ansatz sofort im Eisbad abkühlen, CP durch CPK-Reaktion (C2.4.2) in ATP überführen und darüber wie<br />
oben quantifizieren.
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