Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
Zu 2.7 ml Puffer gibt man 100 µl des zu analysierenden Extraktes (optimieren!), je 5 µl LDH
und PK und justiert das Photometer auf E 340 = 0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H +
(aus A1) startet man die Reaktion mit 100 µl PEP-Lösung. Falls NADH,H + die Reaktion nicht
limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der ADP-Konzentration.
Versuch C2.4.4:- AMP
Prinzip:
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.3 bestimmt man im gleichen Testansatz die AMP-
Konzentration. Die Reaktion sollte sich durch 5 µl Myokinase (MK-Kristallsuspension) starten
lassen. Bitte bei der Rechnung berücksichtigen: aus 1 AMP werden 2 ADP. Falls NADH,H +
die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der erneute Abfall der E 340 ein Maß der AMP-
Konzentration.
Versuch C2.4.5:- Creatin
Prinzip:
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.4 wird der gleiche Ansatz zur Bestimmung von Creatin
vorbereitet. Man stellt mit einer gesättigten K 2 CO 3 -Lösung vorsichtig (!) pH 9.2 ein, versetzt
nochmals mit 100 µl PEP sowie mit 100 µl 75 mM ATP (ADP-frei, aus A2) und justiert das
Photometer mit dieser Mischung auf E 340 =0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H + läßt
sich die Reaktion durch 100 µl (3 mg) Creatinphosphokinase (CPK) starten 11 . Falls NADH,H +
die Reaktion nicht limitiert, ist der Abfall der E 340 ein Maß der Creatin-Konzentration. Zu
dessen Berechnung bitte Verdünnung (durch pH-Einstellung etc.) berücksichtigen.
11 Das Gleichgewicht der CPK-Reaktion hängt stark vom pH-Wert ab; im schwach Sauren liegt es auf der
Seite des Creatin, im Alkalischen auf der des Creatin-phosphats. Da die Wechselzahl des Enzyms gering ist
(25000 mol/(mol . min) bei 38 o ) sind größere Mengen zum schnellen Reaktionsablauf nötig.