Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Standardenthalpie
GAPDH:etwa 20 µg/ml, angesetzt aus einer Kristallsuspension in Puffer 1. ggf. PGK als Hilfsenzym (5 µl
Kristallsuspension)
Man bestimme die enzymatische Aktivität (d.h., die Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung!) sowohl im Vorwärtstest
(analog Versuch A7.3, jedoch bei pH 7, d.h. mit Puffer 2) als auch im Rückwärtstest (analog Versuch A2, jedoch mit Puffer 1 und
PGK als Hilfsenzym); in beiden Fällen sind 100 µl derselben (in ihrer Konzentration optimierten) GAPDH-Lösung einzusetzen.
Beachte, dass bei Anordnung B1 die Enzymkonzentration keine, die Substratkonzentration jedoch die entscheidende Rolle spielt,
während es hier (Sättigungsbedingungen vorausgesetzt) exakt umgekehrt ist.
Ziel:
Das Enzym sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtsreaktion mit maximaler Umsatzgeschwindigkeit
arbeiten zu lassen, gleichzeitig nach den in Kapitel 8.12 genannten Kriterien eindeutig auswertbare Kinetiken zu erhalten
(Stichworte: Anfangssteigung, Tangente an den Ursprung, Computersimulation). Nach Möglichkeit sollte versucht werden, den
Messbereich des Photometers zehnfach zu spreizen (Vollausschlag dann: 0.1 Extinktionseinheiten). Weiterhin können folgende
Parameter variiert werden:
- Substratkonzentrationen oberhalb eines bestimmten Wertes (hohe Konzentrationen geben häufig besser
auswertbare Kinetiken)
- Anwendung des "Hydrazin-Tricks" (Kap. 4.3.2) zum Abfangen des Produktes der Rückwärtsreaktion, d.i. GAP;
man untersuche den Einfluss von 50 mM Hydrazin in Puffer (1) (pH-Kontrolle!).
Aus dem gewonnenen Verhältnis maximaler Reaktionsgeschwindigkeiten bestimme man schließlich die Gleichgewichtskonstante
und hieraus den Wert ∆G o , dieser sollte mit dem Resultat des Versuches B1 übereinstimmen. Eventuelle Abweichungen wären
zu erklären (Stichworte: suboptimaler pH-Wert für Enzym oder Hilfsenzym; Sättigung nicht zu erreichen, K d -Werte für ES und EP
Komplex verschieden etc.).
Literaturdaten (A. Lehninger, "Biochemistry")
D-Glyceraldehyde-3-phosphate + NAD + + P i _ > 1.3-Diphosphoglycerate + NADH,H + ;
∆G o = + 1.5 kcal/mol
The overall reaction has a slightly positive value of ∆G o (+1.5 kcal . mole -1 ) and thus proceeds readily in
either direction depending on the concentration of the reactants.
5.3.3 Versuch B3: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GDH-Reaktion
Glycerinphosphat-DeHydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion:
Das Gleichgewicht der vorgeschalteten TIM-Reaktion liegt auf der Seite des DAP.
Folgende Materialien stehen zur Verfügung:
Enzyme:
Substrate:
GDH und TIM
GAP und G-3P