Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
8.10 Versuch E1: Der Km-Wert der LDH-Pyruvat Reaktion; Inhibition durch
NAD + , ADP, Salicylat oder Oxamat
Substanzen: 1) Puffer
30 mM Na-Phosphat, pH 7.4
2) 20 mM Na-Pyruvat in (1)
3) 4.8 mM NADH,H + in (1)
4) 50 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!!!! Ggf. auf 7.4 stellen!) 30
5a) 75 mM Na-Salicylat (wie (4))
5b) 3 mM Na-Oxamat (wie (4))
5c) 50 mM ADP (wie (4))
6) LDH, 1-5 µl Kristallsuspension in 1 ml (1). Enzym aus Skelettoder
Herzmuskel (s. Fußnote)
Man versetze 2.7-2.79 ml des Puffers (1) mit 100 µl LDH (6) und Inhibitor (wo
zutreffend). Für diese Mischung stellt man das Photometer auf E = 0. Nach Zusatz
von 100 µl NADH,H + (3) kann die E 340 für den Reaktionsbeginn ermittelt werden. Man
starte die Reaktion durch Zugabe von 100, 50, 30, 20 bzw. 10 µl Pyruvat (2) und
registriere den Abfall der E 340 . Gesamtvolumen für alle Ansätze: 3.0 ml.
Entsprechende Versuchsreihen führe man in Gegenwart von 100, 250 und
500 µl (4) bzw. (5) durch und übertägt die gesammelten Daten in ein Lineweaver-
Burk-Diagramm der Form:
- welchen K m -Wert hat Pyruvat
mit dem reinen Kaninchenmuskel-
Enzym?
- hemmen NAD + (Salicylat,
Oxamat, Adenosinphosphate) die
Reaktion kompetitiv, nicht-kompetitiv
oder unkompetitiv? Zur Interpretation
bitte Sonderkapitel 8.13.1 beachten!
- erklären Sie den Befund, dass
Salicylat bzw. Oxamat die Substratbindungsplätze
einnehmen können
- Ist der Schritt 12 des Glycolyseschemas somit sehr anfällig gegen
Produkthemmung (NAD + ) bzw. ist er hemmbar durch Substrat/Produktanaloge?
Aus sekundären Plots der Steigung gegen die Inhibitorkonzentration bzw. der y-
30 die NAD + - Hemmung zeigt sich am besten bei Verwendung des Herzmuskelenzyms. Grund?