Enzkin - Elm-Asse-Kultur

44
Km/Ki
Versuche C1 bitte am frischen Muskelextrakt (Präparat der Gruppe 1) durchführen.
Einwaage an Muskelgewebe sowie Endvolumen erfragen!
6.2.1 Versuch C1.1:Nachweis von ATP
Während der Glycolyse werden zwei Moleküle ATP je Molekül Glucose mehr gebildet als
verbraucht (Kapitel 2.1). Der Nachweis von ATP gelingt auf der Basis des Versuchs A2 mit
den dort angegebenen Lösungen:
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.8 ml der Testmischung (1) und justiert das Photometer damit
auf E 340 = 0. Sodann setzt man 100 µl der NADH,H + -Lösung (2) zu. Zugabe von 100 µl
konzentrierter glycolytischer Lösung ergibt im Falle der Anwesenheit von ATP ein Absinken
der optischen Dichte bei 340 nm. Nach Erreichen eines minimalen E 340 -Wertes stellt man
durch erneute Zugabe von 100 µl der NADH,H + -Lösung sicher, dass dieses nicht zum
limitierenden Faktor geworden ist. Wie hoch ist die ATP Konzentration in glycolyt. Lösung?
6.2.2 Versuch C1.2:Nachweis von 3-PG
Dieser Versuch unterscheidet nicht zwischen freiem 3-PG und solchem in Bindung an
GAPDH (vgl. Formel für das Acylenzym in Kapitel 3.4 und J. Biol. Chem. 246, 780 (1971)). Neben
den Substanzen unter A2 wird benötigt:
1') Testmischung:
80 mM TEA
1 mM EDTA
9 mM MgSO 4 , pH 7.6 (mit HCl).
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.7 ml der Testmischung 1' sowie 100 µl der ATP-Lösung
3). Nach Justieren des Photometers auf E = 0 werden 100 µl NADH,H + -Lösung (2)
zugesetzt. Zufuhr von 100 µl konzentrierter glycolytischer Lösung führt zum Absinken der
Extinktion bei 340 nm, falls diese 3-PG enthält. Wie hoch ist dessen Konzentration in
glycolyt. Lösung? Wird das Ergebnis durch Folgemetabolite des 3-PG (2-PG, Pyruvat,
Lactat) beeinflusst? Überprüfen Sie dies, indem Sie 100 µl 5 mM Lösungen dieser
Metabolite zum obigen Gemisch pipettieren und Änderungen der Extinktion verzeichnen.
6.2.3 Versuch C1.3: Nachweis von DAP und benachbarten Metaboliten
Für den Nachweis werden Substanzen aus A3/A5 benötigt. Man fülle eine QS-Küvette mit
2.7 ml der Testmischung (1) und 5 µl Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Kristallsuspension).
Mit dieser Mischung eiche man das Photometer auf E 340 = 0. Durch
Zugabe von 100 µl NADH,H + (3) erreicht man E 340 = 1. Führt die Zugabe von 100 µl
glycolytischer Lösung zu einer Abnahme der Extinktion bei 340 nm? Kann diese durch
Versetzen mit 100 µl einer 75 mM ATP-Lösung noch gesteigert werden?