Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Aktivitätstests
4.9.3 Versuch A7.3: Aktivitätstest für GAPDH
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe (nicht am 1. Praktikumstag)
Prinzip: vergl. Kapitel 2.1
Substanzen:
1)Testpuffer: 40 mM Triäthanolamin
50 mM Na 2 HPO 4
0.2 mM EDTA, pH 8.5 (HCl)
2) 7.5x10 -3 M NAD +
3) 7.5x10 -3 M D-GAP
4) GAPDH mit einer Protein-Konzentration von 200 µg/ml (Ermittlung gem. Kapitel
1.2.1)
Man fülle eine Küvette wie folgt:
1) Testpuffer 2.7 ml
2) GAP 8 0.1 ml
3) GAPDH 100 µl
Man läßt diese Mischung einige Minuten äquilibrieren, justiert das Photometer auf
E 340 =0 und startet die Reaktion durch Zugabe von 0.1 ml NAD + . Der Wert ∆E 340 je min
ergibt sich dann aus der Reaktions-Anfangsgeschwindigkeit.
Nur wenn NAD + und GAP in sättigender Konzentration vorliegen (überprüfen!), ist
v proportional der spezifischen Aktivität des Enzyms:
spez. Akt. = v [µmol NAD + /(min×mg Enzym)]
Die spezifische Aktivität wird in sog. "enzyme units" angegeben (Definition Kapitel
4.10). Ist Substratsättigung nicht zu erreichen, so ist, bei Kenntnis der K m -Werte von
NAD + und GAP, die folgende Korrektur anzubringen (Biochem. J. 92, 578 (1964)):
- bei einer (angenommenen) End-extinktion von 1.6 ergibt die Kurzformel
1.6 × (3/6.3) = 0.76 µmol GAP in 100 µl
7.6 µmol GAP in 1 ml
7.6 mmol GAP in 1 l;
Sie haben also eine 7.6 mM Lösung angesetzt, die in etwa den Erwartungen entspricht.
- Gegenprobe: Zur Standardisierung wird die gewünschte 7.5 × 10 -3 M Stammlösung 100:3000
verdünnt. Das ergibt eine 2.5 × 10 -4 M Küvettenfüllung.
1 mol/l -> ∆E = 6300
2.5 . 10 -4 mol/l -> ∆E = 1.58
8 Man vergegenwärtige sich, dass die Endkonzentrationen von NAD + und GAP in der Küvette 7.5x10 -
3 x100/3000 = 0.25x10 -3 M (0.25 mM) betragen.