Enzkin - Elm-Asse-Kultur
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Vorgesehenes Seminarpensum:<br />
Tag Kapitel<br />
"ENZYMKINETIK UND ...<br />
- MECHANISMUS"<br />
Texte und Versuchsvorschriften<br />
zum Praktikumsblock BB3<br />
05.12.-16.12.2005<br />
Tag<br />
Kapitel<br />
Mo 1.1,2.1,2.3,2.4,4.10<br />
Versuche A1 bis A6<br />
Di 3.5,8.10,8.13<br />
Versuche A (Rest), Versuch E.2.1<br />
Mi 5<br />
Versuche B<br />
Mo 8.1 - 8.7<br />
Versuch E.2.2<br />
Di 8.8<br />
Versuche E1-E4 (Rest)<br />
Mi 9<br />
Versuche F und Abschlussbesprechung<br />
Do 1,6<br />
Versuche C<br />
Fr 2.2,3.2, 7<br />
Versuche D<br />
Do<br />
Fr<br />
Heimarbeit (Protokolle)<br />
einige schriftliche Wiederholungsfragen<br />
(Klausur)<br />
Jürgen Bode http://enzkin.de.vu<br />
Astrid Hans<br />
Julia Garbe<br />
Svenja Lüders
Inhalt<br />
Enzymkinetik heute<br />
Die Enzymkinetik ist ein in allgemeingültigen Gesetzmäßigkeiten,<br />
Begriffen und Theorie abgeschlossener Teil der Biochemie;<br />
Fortschritte sind daher in diesem klassischen Haus nicht zu erwarten, nur<br />
Ausbauten. So haben die Methoden der Auswertung und Datenverarbeitung<br />
durch elektronische Schnellrechner Routine gewonnen. Statistik ist keine<br />
Mühsal mehr sondern nur einen Knopfdruck weit entfernt...<br />
...die zitierte Literatur geht in Einzelfällen bis in die neuere Zeit, aber man sieht<br />
doch, dass die Enzymkinetik ihren Höhepunkt in der vorigen Generation hatte -<br />
jetzt bewährt sie sich in der Praxis und hat dadurch<br />
eine hoffnungsvolle Renaissance.<br />
Lothar Jänicke (1994) zu “Enzymkinetik - Theorie und Methoden” von Hans Bisswanger; VCH 1994;<br />
N 3-527-30032-5 - gleichzeitig eine Literaturempfehlung.<br />
Ein Biologe ohne enzymkinetische Grundkenntnisse<br />
ist wie ein Haus ohne Fundament...<br />
Leopold Flohé (2000)
INHALTSVERZEICHNIS<br />
1. ALLGEMEINE ARBEITSHINWEISE UND INFORMATIONEN<br />
1.1 Einige Abkürzungen und Definitionen 8<br />
1.2 Methoden zur Bestimmung des Proteingehaltes 10<br />
1.2.1 UV-Methode am Beispiel der GAPDH<br />
1.2.2 Biuret-Methode 10<br />
1.2.3 Methode nach Lowry 11<br />
1.2.3.1 Bicinchoninsäure (BCA-) Variante 12<br />
1.2.4 Fluram- (Fluorescamin-) Methode 13<br />
1.2.5 Bradford-Test 14<br />
1.2.6 Zur Präzision wichtiger Proteinbestimmungs-Verfahren 16<br />
2. METABOLISCHE UND ENZYMOLOGISCHE GRUNDLAGEN<br />
2.1 Schwerpunkt dieses Praktikums: Glycolyse-Enzyme 17<br />
2.2 Stellung der Glycolyse im Energiestoffwechsel 18<br />
2.3 Coenzyme der Dehydrogenasen (GAPDH; GDH; LDH):<br />
NAD + und NADH,H + 19<br />
2.4 Prinzip des Aktivitätstests für NAD + abhängige 20<br />
Dehydrogenasen: der optische Test<br />
3. CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE DATEN<br />
3.1 für NAD + und NADH (molare Extinktionskoeffizienten) 21<br />
3.2 für Phosphofructokinase (PFK) 21<br />
3.4 für GAPDH 23<br />
3.5 für Pyruvatkinase 24<br />
3.5 für LDH 25<br />
4 AKTIVITÄTSTESTS :GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN<br />
4.1 Einleitung zu den Versuchen Versuche A 26<br />
4.2 Präparation des Muskelextraktes (A0) 28<br />
4.3 Aktivitätstests für Lactat-Dehydrogenase 28<br />
4.3.1 "Vorwärtsreaktion" (A1.1)<br />
4.3.2 "Rückwärtsreaktion" (A1.2) 29<br />
4.4 Kombinierter Test für PGK und GAPDH<br />
(Rückwärtstest) (A2) 30<br />
4.5 Kombinierter Test für Aldolase und GAPDH (A3) 31<br />
4.6 Aktivitätstest für Aldolase (Hydrazonbildung) (A4) 31<br />
4.7 Kombinierter Test für Aldolase und Triosephosphat-<br />
Isomerase (A5) 32<br />
4.8 Aktivitätstest für Triosephosphat-Isomerase (A6) 32<br />
4.9 Die "Vorwärtsreaktion" der GAPDH<br />
4.9.1 Darstellung des GAPDH-Substrates (GAP) (A7.1) 33<br />
4.9.2 Standardisierung der GAP-Lösung (A7.2) 33<br />
4.9.3 Aktivitätstest für GAPDH (A7.3) 34<br />
4.10 Rechenbeispiel zu Aktivitätsbestimmungen:<br />
Volumenaktivität und spezifische Aktivität 35<br />
5. ZUR FREIEN STANDARDENTHALPIE (∆G o ) UND FREIEN ENTHALPIE (∆G)<br />
CHEMISCHER REAKTIONEN<br />
5.1 Einleitung zu den Versuchen Versuche B 37<br />
5.2 Freie Standardenthalpien der Glycolysereaktionen 38
4<br />
Inhalt.<br />
5.3 Freie Standardenthalpie der GAPDH- und GDH-Reaktionen 38<br />
5.3.0 Berechnung von Gleichgewichtskonstanten aus<br />
Literaturwerten für ∆G o (B0) 38<br />
5.3.1 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der<br />
GAPDH-Reaktion (Gleichgewichtseinstellung) (B1) 39<br />
5.3.2 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der<br />
GAPDH-Reaktion (kinetischer Ansatz) (B2) 40<br />
5.3.3 Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der<br />
GDH-Reaktion (B3) 41<br />
6. BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN<br />
BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN<br />
• NACH DER ENDPUNKTMETHODE: Versuche C 43<br />
6.1 Das Messprinzip<br />
6.2 Versuche am Kaninchenmuskel-Extrakt (C1) 43<br />
6.2.1 Nachweis von ATP (C1.1) 43<br />
6.2.2 Nachweis von 3-PG (C1.2) 44<br />
6.2.3 Nachweis von DAP und benachbarten Metaboliten (C1.3) 44<br />
6.2.4 Lage des NAD + /NADH,H + -Gleichgewichts im Muskel (C1.4) 44<br />
6.3 Versuche an diversen proteinfreien Extrakten (C2) 46<br />
6.3.1 Herstellung eines Extraktes aus Kaninchenherz (C2.2)<br />
6.3.2 Entproteinieren des Skelettmuskelextraktes<br />
durch Pepsin (C2.2) 46<br />
6.3.3 Metabolitengemisch unbekannter Herkunft (C2.3)<br />
6.3.4 Energiereiche Phosphate: ATP (C2.4.1) 47<br />
6.3.5 ” “ Creatin-Phosphat (CP) (C2.4.2) 48<br />
6..6 Energiemangel-Metabolite: ADP (C2.4.3) 49<br />
" “ AMP (C2.4.4) 49<br />
6.3.8 " “ Creatin (C2.4.5) 49<br />
• NACH DER KINETISCHEN METHODE:<br />
6.4.1 Das Messprinzip 50<br />
6.4.2 Prinzip der Biolumineszenz 50<br />
6.5 Biolumineszenzmessungen mit dem Luminometer 51<br />
6.5.1 Luciferin/Luciferaserpräparat (C3.0) 51<br />
6.5.2 Eichreihe für ATP (C3.1) 51<br />
6.5.3 Energiereiche Phosphate: ATP und Creatin-P (CP) (C3.2) 52<br />
7. REGULATORISCHE ENZYME<br />
7.1 Phosphofructokinase: ein Schlüsselenzym bei der Versuche D 54<br />
Regulation des Metabolitenflusses im Glycolyseweg 54<br />
7.2 Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus von<br />
Effektoren bei oligomeren Enzymen: Beispiel der<br />
Phosphofructokinase der Glycolyse 55<br />
7.3 Zur Regulation der Phosphofructokinase (D1) 56<br />
7.4 Phosphofructokinase, ein kooperatives Enzym (??) (D2) 59<br />
7.5 Pyruvatkinase, ein kooperatives Enzym (?) (D3) 59<br />
8. BESTIMMUNG VON K M UND K I WERTEN<br />
8.1 Sättigungsphänomene: der ES-Komplex Versuche E 62<br />
8.2 Katalytische Effizienz: das k cat /K m -Kriterium 63<br />
8.2.1 Abschätzung der katalytischen Effizienz 64
5<br />
Inhalt.<br />
8.3 Ableitung der Michaelis-Menten Beziehung 66<br />
8.4 Nichtlineare Regression: Angleichung der Michaelis-<br />
Menten-Beziehung 67<br />
8.5 Linearisierung der Michaelis-Menten Beziehung 68<br />
8.5.1 Lineweaver-Burk Auftragung 67<br />
8.5.2 Eadie-Hofstee und Scatchard Auftragungen 68<br />
8.6 Parametervergleich: Bindungsmessungen und Enzymkinetik 69<br />
8.7 Zur Auswertung enzymkinetischer Daten:<br />
Merkmale verschiedener Plots 69<br />
8.7.1 Computergestützte Analyse 69<br />
8.7.2 Bedeutung konventioneller Auftragungen 69<br />
8.7.3 Allosterie und Kooperativität 72<br />
8.7.3.1 Definition und Darstellung kooperativer Bindungsphänomene 73<br />
8.8 Soforttest für Messwerte: die direkt-lineare Auftragung 75<br />
8.9 Enzymhemmungen 76<br />
8.9.1 Die kompetitive Hemmung 77<br />
8.9.2 Die allosterische Hemmung 78<br />
8.9.3 Die "nicht-kompetitive" (allgemeiner: "mixed-type") Hemmung 79<br />
8.9.4 Die "unkompetitive" Hemmung 80<br />
8.9.5 Nomenklaturvorschläge und Definitionen zum Gebiet<br />
der Enzymhemmung und -regulation 82<br />
8.9.6 Bestimmung von K i und K is aus sekundären Plots 82<br />
8.9.7 Dixon-Auftragung zur direkten Ablesung von K i -Werten 85<br />
8.10 Der K m -Wert der LDH-Pyruvat Reaktion; Inhibition<br />
durch NAD + , Salicylat oder Oxamat (E1) 86<br />
8.11 Isoenzyme der Lactat-dehydrogenase (E2) 89<br />
8.11.1 "Hydroxybutyrat-Dehyrogenase"-Aktivität der LDH-<br />
Isoenzyme in Herz und Leber (E2.1) 90<br />
8.11.2 K m -Werte der LDH-Isoenzyme (E2.2) 91<br />
8.12 Der K m -Wert der Alkoholdehydrogenase-Ethanol Reaktion (E3) 93<br />
Berechnung von Inhibitionskonstanten<br />
aus optimierten Datenreihen (E4) 94<br />
8.14 BESONDERHEITEN VON MEHRSUBSTRAT-REAKTIONEN 94<br />
8.14.1 Sequenzieller Mechanismus: geordnet oder willkürlich 95<br />
8.14.2 Ping-pong bi-bi Mechanismus 98<br />
9 TRICKS UND 'trouble-shooting'<br />
9.1 Funktioniert das Photometer? 98<br />
9.2 Optimierung der Versuchsbedingungen bei schlecht<br />
auswertbaren Kinetiken 98<br />
9.2 Prinzip der nichtlinearen Regressionsanalyse<br />
9.2.1 Anfangsgeschwindigkeiten aus der integrierten Michaelis-<br />
Menten Gleichung 99<br />
9.2.2 Anwendung eines Polynoms zur Ermittlung der<br />
Anfangsgeschwindigkeit aus Zeit-Umsatzkurven 99<br />
10. ZUR BEDEUTUNG VON CYSTEINEN FÜR ENZYMATISCHE AKTIVITÄTEN<br />
(REAKTIONSKINETIK) Versuche F 101<br />
10.1 Zur Auswertung von Kinetiken für Reaktionen zweiter Ordnung 102<br />
10.1.1 Reaktion zweiter Ordnung unter ṕseudo-first ordeŕ Bedingungen<br />
10.2 Titration aller Cystein-Reste an GAPDH (F1) 103<br />
10.3 Untersuchung von Cystein-Reaktivitäten in nativer GAPDH (F2) 103
6<br />
Inhalt.<br />
11. APPENDICES 105<br />
• Seminarthemen 106<br />
• Anleitung zum Gebrauch der <strong>Enzkin</strong> Programme 107-113<br />
• Enzymkinetik und -Mechanismus in Wikipedia 114<br />
• Geometrische Eigenschaften einer Hyperbel 115<br />
• Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung 116<br />
• Lösungsweg zur Aufgabe B0 117<br />
• Halblogarithmisches Papier (beim Assistenten)<br />
STICHWORTVERZEICHNIS (Index) 118<br />
ÜBERSICHT: GRAPHISCHE AUSWERTUNGSVERFAHREN (PLOTS) vergl. Kap.8.7<br />
Dixon (K i )<br />
Eadie-Hofstee (K m , K i , V max )<br />
Eisenthal-Cornish-Bowden (K m , V max )<br />
Hanes (K m , K i , V max )<br />
Hill (Kooperativitätsparameter, K m (K 1 , K 2 bzw. n H )<br />
Lineweaver-Burk (K m , Ki , V max)<br />
Halblogarithmische Auftragung (Reaktionskinetik)<br />
******
7<br />
Inhalt.<br />
ÜBERSICHT: ZU BB3 ENTWICKELTES PROGRAMMPAKET<br />
(Hauptkomponenten im Großdruck)<br />
Activity - berechnet Dehydrogenase Aktivitäten<br />
Bestline - lineare Regression<br />
Composit - simuliert zusammengesetzte Hyperbeln u.v.m.<br />
Emod - Kinetik von Enzymgiften<br />
G0 - Berechnung freier chemischer Reaktionsenthalpien<br />
KmVm - nichtlineare Regression: Hyperbel (Vorstufe von MMenten)<br />
Makafil - universelle Dateneingabe; Datenkonversion<br />
zwischen Standard- und Enzfitter-Format<br />
MMenten - graphische Darstellung (primär) für Michaelis-Menten Enzyme<br />
Mr - relative Molekülmasse durch verschiedene Anpassungen<br />
V0 - enzymatische Anfangsgeschwindigkeit<br />
Viewafil - Dateninspektion und graphische Ausgabe<br />
***<br />
EMPFOHLENE KOMMERZIELLE PROGRAMME<br />
Enzpack - Demonstrationsprogramm für Plots, Fehlerverteilung, Inhibitionsphänomene; dieses Programm<br />
erhielt während der Praktika 1987/88 die Fähigkeit zur nichtlinearen Regression; die aktuelle Version (1998)<br />
bietet inzwischen exakt diese Möglichkeiten (Elsevier Biosoft; 199 Euro).<br />
Enzfitter - Nichtlineare Regressionsanalyse beliebiger Funktionen. Ein komfortabler Editor für<br />
Gleichungssysteme ist enthalten. (Elsevier Biosoft; 399 Euro; Demonstrationsversionen beider Programme<br />
unter http://www.biosoft.com). Weiterentwicklung: Grafit; Elsevier Programme werden auch von Sigma<br />
Chemicals vertrieben.<br />
DNRPeasy - Nichtlineare Regressionsanalyse nach Ronald Duggleby, gemeinsame mathematische Basis<br />
mit Composit; viele eingebaute Gleichungen aus dem Bereich der Enzymkinetik; Einbau eigener<br />
Gleichungen ist nur sehr bedingt möglich. Möglichkeit zur Erstellung von Druckerfiles. Zu beziehen von: Dr.<br />
R. G. Duggleby, Department of Biochemistry, University of Queensland, QLD 4072, AUSTRALIA, ca. 50$<br />
Enzfitter korrespondiert mit unserem "Composit" (via Makafil); es besitzt exzellente Graphikfähigkeiten,<br />
insbesondere nach Daten-Aufarbeitung im separaten Programm "Enzplot". Im Unterschied zu Composit und<br />
DNRPeasy erlaubt es nur die Eingabe von Zahlenreihen mit einer unabhängigen Variablen und es erfordert<br />
zumeist die Eingabe von Schätzwerten für die abhängigen Variablen.
Arbeitshinweis<br />
1. ALLGEMEINE ARBEITSHINWEISE<br />
1.1 Einige Abkürzungen und Definitionen<br />
A<br />
(engl. "absorption") steht hier nach internationalen Gepflogenheiten für das<br />
deutsche "E" (Extinktion) und wird auch gleichbedeutend mit "OD" (optische<br />
Dichte) gebraucht. A 340 / E 340 / OD 340 wäre die Absorption/ Extinktion/ optische<br />
Dichte bei einer Wellenlänge von 340 nm. A ist ein Maß der Reagenzkonzentration<br />
in Lösung, Proportionalitätsfaktor ist der molare<br />
Extinktionskoeffizient, ε. "d" ist die Schichtdicke der Küvette, hier durchweg<br />
gleich 1 [cm].<br />
A≡ E = ε ⋅c⋅d<br />
Achtung: in deutschen Lehrbüchern der Physikochemie wird die Absorption gelegentlich als<br />
Kehrwert der Transmission (1/T) definiert, hier als log(1/T).<br />
BPG<br />
c<br />
1,3-Bisphosphoglycerinsäure<br />
Molare Konzentration (Molarität einer Lösung. Einheit: mol/l (früher: M). Für<br />
NAD + wäre eine Lösung mit 1 mol/l eine solche mit 663.4 g/l (663.4 mg/ml).<br />
DAP Dihydroxyaceton-phosphat.<br />
DPG 1,3- Diphosphoglycerinsäure jetzt 1,3-Bisphosphoglycerinsäure<br />
ε In dieser Schreibweise handelt es sich um den molaren<br />
Extinktionskoeffizienten, die hypothetische Extinktion (Absorption, optische<br />
Dichte) einer Lösung mit 1 mol/l. Eine sinnvolle Angabe schließt die Wellenlänge<br />
in nm mit ein, z.B. "ε 340 ".<br />
Achtung: Angaben wie ε 280 1% sind durchaus üblich und kennzeichnen die Extinktion einer<br />
1%igen Lösung (d.h. einer solchen mit 10 mg/ml) bei 280 nm.<br />
E<br />
Extinktion; siehe A (Absorption)<br />
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure; wichtiger Chelator für Ca ++ /Mg ++ und üblicher<br />
Pufferzusatz; Handelsbezeichnung: Titriplex III (Merck).<br />
" enzyme unit"<br />
Gängige Einheit enzymatischer Aktivitäten. 1 unit: 1 µmol Substratumsatz je<br />
min. Eine weitere gängige Aktivitätseinheit ist das katal (abgekürzt kat). 1 unit<br />
= 16,67 nkat.<br />
Achtung: Viele andere, individuell definierte units sind im Umlauf. Beispiel: 1 unit einer<br />
Restriktionsendonuclease setzt für den Genetiker 1 µg lambda-DNA in der Stunde um!<br />
PFK Phosphofructokinase, auch Fructose-6-phosphat-kinase. Es gibt neuerdings<br />
zwei Varianten, die keine Isoenzyme sind: PFK1 und PFK2.<br />
F-1,6 DP/F-1.6BP<br />
Fructose-1,6-dihosphat (jetzt: Fructose-1,6-bis-phosphat)<br />
GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat.<br />
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase.
Arbeitshinweis<br />
GDH Glycerinphosphat-dehydrogenase.<br />
M<br />
M<br />
M r<br />
Heute: Molekülmasse; Beispiel NAD + : 663.4 g (Gramm).<br />
Früher: Molarität. Eine 1 M Lösung enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml.<br />
Relative Molekülmasse; Beispiel NAD + : 663.4 (dimensionslos! Vielfaches von<br />
1 / 12 C).<br />
m<br />
NAD +<br />
Molekulare Masse; Beispiel NAD + : 663.4 Da (Dalton).<br />
ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (ganz früher: DPN).<br />
NADH,H + Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduzierte Form.<br />
NBS - 5-Thio-2-nitrobenzoesäure (Thiolat-Anion)<br />
(NBS) 2 Früher: DTNB; 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)(3,3'-6)<br />
PGK 3-Phosphoglyceratkinase.<br />
3-PG 3-Phosphoglycerat.<br />
P i<br />
T<br />
TEA<br />
TIM<br />
Anorganisches Phosphat.<br />
Transmission;<br />
primärer Messparameter von Photometern, abgeleitete Größen siehe unter "A". Der moderne<br />
Biologe wird dem "T" kaum noch begegnen und verläßt sich darauf, dass sein Photometer<br />
einen T-E-Wandler enthält. Bei Praktikumsgeräten ist dies allerdings nicht so selbstverständlich.<br />
Triethanolamin;<br />
freie Base oder Hydrochlorid. Gängige Puffersubstanz im pH-Intervall 7-9. TEA x HCl (pH 8)<br />
wäre eine TEA-Lösung, welche mit HCl auf pH 8 gestellt ist.<br />
Triosephosphat-isomerase (überführt GAP in DAP und umgekehrt).<br />
Tris-Acetat Tris-Lösung, die mit Hilfe von Essigsäure auf den angegebenen pH- Wert<br />
gebracht worden ist.
Arbeitshinweis<br />
1.2 Methoden zur Bestimmung des Proteingehaltes<br />
1.2.1 UV-Methode am Beispiel der GAPDH<br />
Der molare Extinktionskoeffizient für den typischen GAPDH/NAD + -Komplex bei 276<br />
nm ist 146000, die relative Molmasse (M r ) 144000; eine Lösung von 1 mg/ml<br />
GAPDHx3NAD + wiese also eine E 276 von 146/144 = 1.01 auf. Die<br />
Proteinkonzentration ergibt sich allgemein durch Messung der E 276 und Multiplikation<br />
mit 0.99:<br />
E<br />
⋅ . = mg / ml<br />
276<br />
099<br />
GAPDHx3NAD + ist die Form, in der das Enzym aus Kaninchenmuskel normalerweise<br />
isoliert wird. Um den variablen Gehalt an Coenzymen zu berücksichtigen, wird die<br />
Verwendung der Beziehung<br />
empfohlen.<br />
(. 155⋅E ) −( 076 . ⋅ E ) = mg<br />
/ ml<br />
280 260<br />
1.2.2 Biuret-Methode (zur Zeit nicht durchgeführt)<br />
Prinzip: das Kupfer-Ion wird zum Zentralatom eines violetten Farbkomplexes, der sich in Gegenwart von Peptidbindungen bzw.<br />
zwei Säureamidbindungen bildet. Ob Kupfer im Komplex zweiwertig bleibt oder teilweise zu Cu + reduziert wird ist unklar ( vergl.<br />
Anal.<br />
Biochem. 150, 76, 1985)<br />
Abb. 1.1 Biuret-Reaktion; Struktur des Biuret-Cu ++ -Komplexes<br />
a, Die Abhängigkeit der Biuret-Reaktion von der -CO-NH- (d.h. Peptid-) Gruppierung<br />
b, dto., gebildet mit der -CO-NH 2 (d.h. Biuret-) Gruppe<br />
c, Aminosäuren binden Cu ++ chelatartig, jedoch ohne Bildung von Farbkomplexen.<br />
Die Biuret-Methode ist weitgehend störungsfrei, da im kritischen Wellenlängenbereich nur Gallenfarbstoffe eine<br />
schwache Extinktion aufweisen. Proteine sind die einzigen Substanzen in biologischen Materialien, die eine Biuret-Reaktion<br />
ergeben. Allerdings versagt die beschriebene Variante in Gegenwart von Ammoniumsalzen.<br />
Die Farbentwicklung der Biuret-Komplexe ist bei verschiedenen Proteinen weitgehend konstant (d.h. proportional der<br />
Kettenlänge). In dieser Hinsicht ist die Methode den anderen hier beschriebenen Verfahren überlegen. Allerdings benötigt sie<br />
wesentlich mehr Material.<br />
Materialien:<br />
CuSO 4 . 5H 2 O<br />
Na-K-Tartrat (NaKC 4 H 4 O 6 . 4H 2 O)<br />
75% NaOH-Lösung (Carbonat-frei, in Plastikflasche)<br />
0.1% KJ (bei Bedarf)<br />
BSA (bovine serum albumin) als Eichprotein<br />
Daten:BSA, ε 280 1% : 6.6(Wert einer Lösung mit 10 mg/ml)<br />
Biuret-Reagens:<br />
150 mg CuSO 4 . 5H 2 O und 600 mg Na-K-Tartrat in je 10 ml H 2 O lösen. Lösungen vereinigen und auf 50 ml auffüllen . Auf dem<br />
Magnetrührer 30 ml 10%iger NaOH-Lösung (aus obiger Stammlösung) zusetzen und mit H 2 O auf 100 ml auffüllen. In einer<br />
Plastikflasche ist dieses Reagens langfristig haltbar. Die Einstellung auf 0.1% KJ wirkt stabilisierend d.h. verhindert die
11<br />
Arbeitshinweis<br />
Reduktion des Reagens. Die Lösung muss beim Auftreten roter oder schwarzer Präzipitate verworfen werden.<br />
Eichreihe (allgemeine Vorschrift):<br />
140 mg BSA oder Eiweiß-Lysozym einwiegen und in 5 ml H 2 O (bzw. Probenpuffer)<br />
lösen. Auffüllen auf 10 ml. Extinktion einer 1:10 Verdünnung messen.<br />
Sollwerte für 1 mg/ml<br />
BSA: E 280 = 0.66<br />
Lysozym: E 281,5 = 2.64<br />
V o ml der Stammlösung durch Verdünnen (d.h. Zugabe von<br />
BSA:<br />
Lysozym:<br />
∆v = V o (E 280 /0.66) - V o bzw.<br />
∆v = V o (E 281,5 /2,64) - V o<br />
ml) auf 10 mg/ml einstellen. Verdünnungsreihe ansetzen:<br />
1)100 µl Stammlösung + 900 µl Puffer : 1mg/ml (Sollwert)<br />
2) 200 µl " + 800 µl " : 2mg/ml<br />
...<br />
...<br />
...<br />
9) 900 µl " + 100 µl " : 9mg/ml<br />
10)Stammlösung:<br />
10mg/ml<br />
Durchführung:<br />
In Plastik-Küvetten werden 400 µl Proben (mit 1-10 mg BSA/ml) mit 1.6 ml Biuret Reagens versetzt. Die Proben stehen nach<br />
guter Durchmischung für 30 min bei Raumtemperatur. Analog verfährt man mit 400 µl einer adäquaten Verdünnung des<br />
Muskelextraktes. Eine Blindprobe enthält 400 µl H 2 O (bzw. Probenpuffer) und 1.6 ml Biuret Reagens.<br />
Man misst die Extinktion aller Proben bei 550 nm und konstruiert eine Eichkurve, aus der dann die Konzentration der<br />
unbekannten Proben abgeleitet wird.<br />
Für die Auswertung sollten nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden. Nur in diesem Fall ist eine<br />
Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline");<br />
"Bestline" führt eine Standard-lineare- Regressionsanalyse durch; der zwangsläufige Ursprung [0,0] wird nicht<br />
berücksichtigt. Soll die Regressionsgerade durch den Nullpunkt verlaufen, so kann das Polynom nach Kap. 9.2.2, d.h.<br />
eine Funktion des Programms "Composit" eingesetzt werden. Eine Ursprungsgerade folgt, wenn a o , a 2 und a 3 gleich<br />
1E-27 gesetzt und maskiert werden. Betreuer fragen!).<br />
1.2.3 Methode nach Lowry (Zur Zeit nicht durchgeführt)<br />
J. Biol. Chem. 193, 265 (1951); Meth. Enzymol. III, 448<br />
Die nach Lowry modifizierte Folin-Methode hat gegenüber einer Extinktionsmessung bei 280 nm den Vorteil einer 10-<br />
20fach höheren Empfindlichkeit; sie ist 100x so empfindlich wie die Biuret-Methode. Aber: Das Verfahren kann in Abhängigkeit<br />
vom Protein zu unterschiedlichen Farbwerten führen, und die erzielte Farbe ist nicht immer direkt proportional der Proteinkonzentration.<br />
Die Farbentwicklung beruht auf<br />
- der Biuret-Reaktion von Peptiden mit Cu ++ im alkalischen Milieu<br />
- der Reduktion von Phosphomolybdän/Phosphowolframsäure durch Tyrosin- und Tryptophanreste des Proteins.<br />
Reagenzien:<br />
Folin-Ciocalteau-Reagens (kommerziell erhältlich).<br />
(Der Herstellungsgang für sparsame Naturen:<br />
Eine Mischung aus 100 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 25 g Na 2 MoO 4 2H 2 O, 50 ml 85 % H 3 PO 4 , 100 ml konz. Salzsäure und 700 ml H 2 O<br />
werden für 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Die Mischung wird mit 150 g Li 2 SO 4 , 50 ml H 2 O und einigen Tropfen wässriger Br 2 -<br />
Lösung versetzt, für 15 min nochmals ohne Kühler zum Sieden erhitzt und gekühlt. Nach Auffüllen auf 1 Liter wird filtriert. Falls<br />
das Produkt eine grünliche Farbe hat, ist es unbrauchbar, die Prozedur ist zu wiederholen!!).<br />
1) 2 % Na 2 CO 3 in 0.1 M NaOH
12<br />
Arbeitshinweis<br />
2) 0.5 % CuSO 4 5H 2 O in 1 % K-Tartrat<br />
Ansetzen als separate Lösungen mit 1 % Cu-Sulfat bzw. 2% K-Tartrat, dann im Verhältnis 1:1 mischen<br />
3) Gebrauchslösung: 50 ml (1) + 1 ml (2);<br />
vor Gebrauch ansetzen. Empfindlichkeitsverlust bei Raumtemperatur ca 40% je Woche.<br />
4) eine 1:3 Verdünnung des Folin-Ciocalteau-Reagenz<br />
Durchführung<br />
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA (analog Kapitel 1.2.2). Hierfür werden die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 200fach<br />
verdünnt (Endkonzentrationen 5-50 µg/ml). 0.3 ml dieser Verdünnungen werden in Plastik-Küvetten mit 1,5 ml<br />
Gebrauchslösung (3) versetzt, gemischt und für 15 min belassen. Unter Schütteln werden dann 200 µl Folin-Reagenz (4)<br />
zupipettiert. Nach mindestens 30 min wird die Extinktion bei 750 nm abgelesen. Der Muskelextrakt wird wie die Eichlösungen<br />
verdünnt und mit deren Extinktionswert verglichen.<br />
Für die Auswertung sollten nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden. Nur in diesem Fall ist eine<br />
Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline"; verg. Kap.<br />
1.2.2). Für sehr konzentrierte Proben kann man vom Extinktionsmaximum abweichen und Messungen, z.B. bei 500 nm,<br />
durchführen. Es ist strikt darauf zu achten, dass die auszuwertenden Proteinlösungen frei sind von Reduktionsmitteln (2-<br />
Mercaptoethanol, Dithiothreitol o.ä.; siehe Prinzip der Farbentwicklung). Einige nichtionische Detergentien sowie gängige<br />
Puffersubstanzen können durch Präzipitatbildung mit dem Folin-Reagens stören.<br />
1.2.3.1 Bicinchoninsäure-(BCA-)Variante<br />
Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985)<br />
Das Folin-Reagens hat den Nachteil hoher Instabilität<br />
im alkalischen Milieu und gelegentlicher unerwarteter<br />
Präzipitatbildung. Smith et al. nutzten die Tatsache,<br />
dass reduzierende Proteinreste stöchiometrische<br />
Mengen des Cu ++ zu Cu + reduzieren, die Biuretreaktion<br />
mit einer Cu + -abhängigen Farbreaktion zu koppeln<br />
Reagens A<br />
Reagens B<br />
1 g BCA 4 g CuSO 4 x5H 2 O Abb. 1.2 Prinzip der BCA-Reaktion<br />
2 g Na 2 CO 3 xH 2 O in 100 ml H 2 O<br />
160 mg Na-Tartrat<br />
400 mg NaOH<br />
950 mg NaHCO 3<br />
- auffüllen auf 90 ml - ggf. pH-Wert (Soll: 11.25) korrigieren mit NaOH<br />
- auffüllen auf 100 ml<br />
Arbeitslösung (mindestens eine Woche stabil): 10 ml Reagens A plus 200µl Reagens B<br />
Durchführung<br />
A - Küvettenverfahren<br />
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA (analog Kapitel 1.2.2). Hierfür werden<br />
die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 300fach verdünnt (Endkonzentrationen 3.3-33<br />
µg/ml). In Plastik-Küvetten werden 0.1 ml dieser Proben mit 2 ml Arbeitslösung<br />
gemischt und entweder für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder für 30 min bei 37 o<br />
inkubiert; nach diesen Zeiten beträgt der Extinktionsanstieg noch etwa 0.25%/min.<br />
Eine Inkubation bei 60 o (30 min) ist ebenfalls möglich und soll helfen, proteinspezifische Unterschiede
13<br />
Arbeitshinweis<br />
zu minimieren.<br />
Messungen erfolgen bei Raumtemperatur im Photometer bei 562 nm. Ein<br />
Blindwert (proteinfreie Probe) ist von den Messungen abzuziehen. Der Muskelextrakt<br />
wird wie die Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswert verglichen.<br />
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve<br />
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in<br />
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit<br />
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Es ist strikt darauf zu achten, dass die auszuwertenden<br />
Proteinlösungen frei sind von Reduktionsmitteln (2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol,<br />
reduzierende Zucker; siehe Prinzip der Farbentwicklung). Chelatoren (EDTA) sind beim Ansatz der<br />
Eichreihe zu berücksichtigen. Keine Störung durch nichtionische Detergenzien sowie die gängigen<br />
Puffersubstanzen.<br />
B -<br />
ELISA-Reader (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)<br />
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren<br />
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe<br />
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl<br />
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer<br />
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.<br />
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Die Platte wird bei 60 o für<br />
30 min inkubiert und dann im ELISA-Reader bei 562 nm ausgewertet. Zur Linearität<br />
der Eichkurve und zur Auswertung: siehe unter A.<br />
Eigentliche ELISA-Tests gehören zu Standardverfahren der Immunologie. Z.B. wird ein<br />
(nachzuweisendes) Antigen an die Oberfläche der Mikrotiterplatte gebunden. Zugabe eines<br />
spezifischen (ersten) Antikörpers schafft einen stationären Antigen-Antikörperkomplex. Der erste<br />
Antikörper wird über eine ubiquitäre Sequenz (z.B. am F c -Teil) durch einen (käuflichen) zweiten<br />
(Fusions-)Antikörper erkannt. Dieser zweite Antikörper wurde mit einem Enzym (z.B. alkalischer<br />
Phosphatase) gekoppelt, das ein chromogenes Substrat zum Farbstoff umsetzt. Auftreten des<br />
Farbstoffes läßt also auf Gegenwart des Antigens schließen. Im Praktikum wird die Tatsache genutzt,<br />
dass jeder ELISA-Reader im Prinzip ein Photometer und eine bequeme Registriereinheit beinhaltet.<br />
Allerdings wird nicht kontinuierlich, sondern in Intervallen registriert (was ist zu beachten?)<br />
1.2.4 Fluram (Flurescamin)-Methode (Zur Zeit nicht durchgeführt)<br />
J. Bode (1979) On the reactions of Fluorescamine with chromosomal proteins. Anal. Biochem. 99, 274-280<br />
Prinzip: Fluorescamin, ein nichtfluoreszierendes Furanon, hat die<br />
Eigenschaft, mit Protein-Aminogruppen zu einem fluoreszierenden<br />
Pyrrolinon zu reagieren. Diese Reaktion hat eine Halbwertszeit von<br />
500 ms; überschüssiges Reagenz wird in wässriger Lösung durch<br />
Hydrolyse des Lactons in wenigen Sekunden "desaktiviert".<br />
Abb. 1.3: Fluorescamin-Reaktion<br />
Substanzen:<br />
1) Fluorescamin-Lösung:<br />
mg "Fluram" (Roche) gelöst in 100 ml trockenem Aceton
14<br />
Arbeitshinweis<br />
2) Puffer<br />
0.1 M Borsäure, Na + -Salz, pH 10.<br />
Durchführung<br />
Man fülle große (20 ml) Szintillationsgefäße mit je 2 ml (2) und pipettiere dazu 100 µl der zu bestimmenden Lösung<br />
mit 1-10 µg an Protein (auch wesentlich weniger ist möglich). Jedes Gefäß wird auf dem Vortex-Mixer kräftig geschüttelt und<br />
während des Schüttelns über eine Eppendorf Mehrfachpipette mit je 200 µl (1) versetzt. Entsprechend verfahre man mit den<br />
Eichlösungen. Die im Praktikum angesetzten BSA-Lösungen enthalten 1-10 mg BSA/ml, d.h., 100-1000 µg/100 µl, welche dann<br />
noch 100fach verdünnt werden müssten.<br />
Alle Proben stehen nach der Zugabe von (1) noch mindestens 15 min, dann wird ihre Fluoreszenz am Eppendorf-<br />
Gerät gemessen, möglichst in der Reihenfolge ihres Ansatzes.<br />
Primärfilter: 405 + 436 nm<br />
Sekundärfilter: 470-3000 nm.<br />
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve berücksicht werden; ggf.<br />
müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses<br />
durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2).<br />
1.2.5 Bradford-Test (Protein Assay, vertrieben von Bio-Rad)<br />
Analytical Biochemistry 72, 248-254 (1976)<br />
Prinzip: M. Bradford beschreibt ein Protein-Bestimmungsverfahren, das auf der<br />
Bindung von Coomassie Brillant Blue G-250 an Proteine beruht. Der gleiche<br />
Farbstoff wird nach einem Färbe-Entfärbezyklus auch zur Visualisierung von<br />
Proteinen auf Polyacrylamidgelen benutzt. In Lösung funktioniert der Test nur<br />
deshalb, weil der Chromophor infolge des Bindungsvorganges einer spektralen<br />
Verschiebung von 465 auf 595 nm unterliegt; der Extinktionsanstieg bei 595 wird<br />
gemessen. Infolge seiner Einfachheit und geringen Störanfälligkeit gehört dieser Test<br />
mittlerweile zu den meistgebrauchten Routineverfahren und ist dabei, die klassische<br />
Reaktion nach Lowry abzulösen. Störungen wurden nur aufgrund verschiedener<br />
Detergenzien (SDS, Triton X-100 und Haushaltsreagenzien) berichtet, für welche<br />
Korrekturen eingeführt werden müssten. Entsprechendes gilt, wenn durch<br />
Anwesenheit stärkerer Puffer der saure pH-Wert verlassen wird. Kationen und<br />
Zucker stören bei keiner der gängigen Konzentrationen.<br />
Durchführung<br />
Präparation des Protein-Reagens<br />
70 mg Coomassie Brillant Blue G-250 oder R (Serva) werden in 50 ml 95%igem Ethanol gelöst. Zu<br />
dieser Lösung gibt man 100 ml 85% (w/v) Phosphorsäure und verdünnt die erhaltene Mischung auf 1<br />
l mit destilliertem Wasser. Damit werden die folgenden Endkonzentrationen erhalten:<br />
- 0.007% (w/v) Coomassie Brillant Blue G-250<br />
- 4.7% (w/v) Ethanol<br />
- 8.5% (w/v) Phosphorsäure)<br />
Das gleiche Reagens erhält man durch 1:5 Verdünnung des kommerziellen Biorad-<br />
Reagens mit Wasser!
15<br />
Arbeitshinweis<br />
A - Küvetten-Verfahren<br />
Man erstellt zunächst eine Eichkurve mit BSA bzw. Lysozym (analog Kapitel 1.2.2).<br />
Hierfür werden die Stammlösungen (1-10 mg/ml) 200fach verdünnt (Endkonzentrationen<br />
5-50 µg/ml). In Plastik-Küvetten werden 100 µl der Lösungen mit<br />
1.9 ml des Protein-Reagens versetzt. Nach gründlicher Durchmischung (Vortex!)<br />
stehen die Proben 30 min, bevor sie gegen einen 'blank' (aus 100 µl Puffer plus 1.9<br />
ml Protein-Reagens) bei 595 nm vermessen werden. Der Muskelextrakt wird wie die<br />
Eichlösungen verdünnt und mit deren Extinktionswerten verglichen.<br />
Grundsätzlich sollten für eine die Auswertung nur Konzentrationen im linearen Teil der Eichkurve<br />
berücksicht werden; ggf. müssen für die Eichkurve stärkere Verdünnungen angesetzt werden. Nur in<br />
diesem Fall ist eine Optimierung des Ergebnisses durch lineare Regressionsanalyse sinnvoll (z.B. mit<br />
Hilfe des Programms "Bestline"; vergl. Kap. 1.2.2). Bei Anwendung des Verfahrens bitte den<br />
ungewöhnlichen Farbwert des gängigen Eichproteins BSA beachten (vergl. 1.2.6). Lysozym wäre<br />
eine bessere Wahl.<br />
B - ELISA-Reader<br />
In die Löcher der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden je 190 µl, in alle weiteren<br />
Löcher je 100 µl der Gebrauchslösung vorgelegt. Parallele Löcher der ersten Reihe<br />
werden sodann mit 10 µl H 2 O oder 10 µl Lysozym-Standard (3 mg/ml) bzw. je 10 µl<br />
der zu messenden Probe versehen. Von diesen Gemischen werden mit einer<br />
Multikanalpipette 100µl entnommen und in die Vorlage der zweiten Reihe pipettiert.<br />
Man fährt so fort und erhält jeweils eine 1:2 Verdünnung. Nach Zugabe von 100 µl<br />
Bradfordlösung in jedes Loch können die Proben nach 2 min im ELISA-Reader bei<br />
595 nm vermessen werden. Aus den gemessenen Eichwerten läßt sich eine<br />
Eichgerade erstellen (zumeist bis 1.5 Extinktionseinheiten linear) und damit lässt sich<br />
der Proteingehalt der Proben direkt ermitteln.<br />
Bitte auch Ausführungen zur Eichgerade unter A beachten.
16<br />
Arbeitshinweis<br />
Abb. 1.4 Vergleich des Bradford- und des Lowry Tests hinsichtlich Empfindlichkeit, linearem Respons<br />
und Reproduzierbarkeit<br />
1.2.6 Zur Präzision wichtiger Proteinbestimmungsverfahren<br />
Tabelle 1.1: Vergleich der Bradford, Lowry und Biuret Protein Assays<br />
Alle Assays wurden an Verdünnungen von gravimetrisch eingestellten 10 mg/ml Lösungen<br />
vorgenommen. Angegeben sind Assay-Resultate in [mg/ml]<br />
Biuret Lowry(BCA) Bradford<br />
1 Alkohol Dehydrogenase 5.8 5.0 7.8<br />
2 α-Amylase 6.8 6.0 8.3<br />
3 bovine serum albumin ( BSA) 9.7 8.4 21.1!!<br />
4 Carbonsäure Anhydrase 8.8 8.9 13.0<br />
5 Catalase 7.6 6.3 9.7<br />
6 α-Chymotrypsin 9.4 11.6 7.8<br />
7 Ovalbumin 10.2 10.1 9.4<br />
8 Fibrinogen 6.2 7.3 7.8<br />
9 γ-Globulin (Kaninchen) 9.4 11.8 8.0<br />
10 ß-Galactosidase 9.5 9.9 7.9<br />
11 Histone 9.7 9.2 15.8<br />
12 Hämocyanin 6.6 5.4 9.2<br />
13 Lysozym 10.4 12.6 9.9<br />
14 Ovomucoid 7.8 8.3 5.9<br />
15 Pepsin 9.8 12.4 4.1<br />
16 Ribonuclease 11.8 15.9 5.3<br />
17 Trypsininhibitor (Soja) 9.1 10.3 6.1<br />
18 Transferrin 8.5 9.0 12.6<br />
19 Trypsin 11.4 15. 54.9<br />
20 Thyroglobulin 7.7 8.2 9.3<br />
Mittel 8.81 9.61 9.20<br />
+/-1.66 +/-3.04 +/-4.00
17<br />
Metabolismus<br />
2. METABOLISCHE UND ENZYMOLOGISCHE GRUNDLAGEN<br />
2.1 Schwerpunkt dieses Praktikums: Glycolyse-Enzyme<br />
aus der alkoholischen Gärung: Enzyme 10, 11<br />
aus dem Stoffwechsel der Fette: Enzyme 13, 14<br />
CH2O-P<br />
CH-OH<br />
CH2OH<br />
Fette<br />
NAD+<br />
NADH,H+<br />
DAP<br />
-3,42<br />
+0.5<br />
-3.4<br />
F-1.6BP<br />
+1.83<br />
GAP<br />
+1.5<br />
BPG<br />
+0.44<br />
+1.06<br />
-4.7<br />
-6<br />
-5.72<br />
3-PG<br />
aus dem Phosphogluconatweg: Enzym 15<br />
Acetat<br />
Fetts@uren<br />
1 :Hexokinase 10:Pyruvat-decarboxylase<br />
2 :Phosphohexose-isomerase 11:Alkohol-dehydrogenase (ADH)<br />
3 :Phosphofructokinase (PFK) 12:Lactat-dehydrogenase (LDH)<br />
4 :Aldolase 13:Glycerinphosphat-dehydrogenase (GDH)<br />
4a:Triosephosphatisomerase (TIM) 14:Acetaldehyd-dehydrogenase<br />
5 :Glycerinaldehyd-3-P 15:Glucose-6-phosphatdehydrogenase<br />
-dehydrogenase (GAPDH)<br />
6 :Phosphoglycerat-kinase (PGK) NIE verwechseln:<br />
7 :Phosphoglycerat-Mutase GAPDH mit GDH.<br />
8 :Enolase Zahlenwerte an den Reaktionspfeilen<br />
9 :Pyruvat-kinase sind hier ∆G o -Werte (kcal/mol) zu Kap. 5<br />
10 :Pyruvat-decarboxylase
18<br />
Metabolismus
19<br />
Metabolismus<br />
2.3 Coenzyme der Dehydrogenasen (GAPDH, GDH, LDH)<br />
Die wasserstoffübertragenden Enzyme der Gärung enthalten als Coenzym<br />
Dinucleotide, deren eine Nucleobase ein Pyridinderivat (das Nicotinsäureamid) ist:<br />
NAD + (Nicotinamid-adenin-dinucleotid) und NADP + (Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat).<br />
In den Coenzymen ist der Pyridinring glycosidisch mit Ribose verknüpft. Eine<br />
derartige Bindung ist offensichtlich nur mit dem Pyridinium-Kation, dessen Stickstoff<br />
protoniert ist, möglich. Über eine Pyrophosphosäuregruppierung ist das<br />
Nicotinsäureamid-ribosid mit Adenosin verbunden:<br />
Abb. 2.1: Nicotinamid-adenindinucleotid<br />
Kompetitoren dieses Coenzyms<br />
sind ADP, bzw. Moleküle, die den<br />
Nicotinamidteil simulieren<br />
(Salicylsäure, siehe 8.10)<br />
In Enzymbindung wird die positive Ladung vom Stickstoff an die Position 4<br />
delokalisiert, wo sie Anlagerung eines Hydridions (H - ) fördert; Gegenion ist ein<br />
Proton (H + ):<br />
Abb. 2.2 Reduktion des NAD + : Aufnahme von H -/ H +<br />
Wie ersichtlich, wird bei diesem Vorgang die aromatische Natur des Ringes<br />
aufgehoben (Delokalisierung erzeugt die "Racker-Bande" im GAPDH-NAD +<br />
Komplex, d.h. eine schwache Extinktion bei 365 nm). Anlagerung des Hydridions
20<br />
Metabolismus<br />
erzeugt eine starke Extinktionsbande bei 340 nm.<br />
2.4 Prinzip des Aktivitätstests für NAD + -abhängige Dehydrogenasen: der<br />
optische Test<br />
Die bei der Reduktion des Nicotinsäureamidringes auftretende Extinktion bei 340 nm<br />
dient als Messparameter zur Verfolgung von Dehydrogenasereaktionen. Die<br />
Zunahme der Extinktion je Zeiteinheit ist damit ein direktes Maß der<br />
Reaktionsgeschwindigkeit; bei hoher Substratkonzentration ( Enzymsättigung) ist sie<br />
der Enzymkonzentration proportional. Dieser "optische Test" ist für die (klinische)<br />
Laboratoriumspraxis von großer Bedeutung:<br />
Abb. 2.3: UV-Spektrum der<br />
Pyridinnuclotide:<br />
die reduzierte Form weist ein<br />
Maximum bei 340 nm auf<br />
Abb. 2.4: "optischer Test" einer<br />
NAD + -abhängigen Dehydrogenase<br />
die Extinktionsänderung ist gegen die<br />
Zeit aufgetragen. Mit mehr Enzym<br />
verläuft die Reaktion schneller<br />
Da NADH,H + nicht nur eine Extinktionsbande (E 340 ) aufweist, sondern durch<br />
Bestrahlen mit Licht einer Wellenlänge von 340 nm auch zur Fluoreszenz (F 495 )<br />
angeregt werden kann, steht ein weiteres, um viele Größenordnungen<br />
empfindlicheres Messprinzip zur Verfügung.
21<br />
Daten<br />
3 CHEMISCHE UND PHYSIKALISCHE DATEN<br />
3.1 für NAD + und NADH,H + (molare Extinktionskoeffizienten)<br />
NAD + : ε 259 = 17800 (cm 2 /mmol) 1<br />
NADH,H + : ε 340 = 6300 (cm 2 /mmol)<br />
Ist ε für eine Substanz bekannt, so kann aus einer gemessenen E die Konzentration<br />
berechnet werden:<br />
c =<br />
E /ε<br />
Es läßt sich weiter ableiten, dass die Menge an NADH,H + , die in einer Reaktion<br />
oxidiert oder die Menge von NAD + , die in einer Reaktion reduziert wird, aus der<br />
gemessenen Änderung der Extinktion, ∆E, berechnet werden kann.<br />
Beispiel:<br />
∆E 340 = 1 = 0.16 µmol NADH/ml<br />
Unbelehrbare Personen überzeugen sich von diesem Sachverhalt mit Hilfe des<br />
Programms "Activity"<br />
3.2 Phosphofructokinase (ATP-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferase,<br />
Enzym des Schrittes 3, EC 2.7.1.11)<br />
Eine ausführlichere Würdigung regulatorischer Eigenschaften der PFK<br />
(insbesondere des Glucagoneffektes) folgt in Kapitel 7 des Umdruckes.<br />
Prinzip: PFK ist eine oligomere Phosphotransferase, gleichzeitig das zentrale<br />
regulatorische Enzym der Glycolyse. PFK wird durch die Gegenspieler<br />
Insulin/Glucagon aktiviert bzw. gehemmt. Insulin induziert das Enzym nicht nur,<br />
sondern aktiviert es auch unter Vermittlung des cytosolischen pH-Wertes.<br />
PFK zeigt eines der ausgeprägtesten für Enzyme beschriebenen pH-Profile, indem ihre Aktivität<br />
innerhalb 0.1 pH-Einheiten von nahe Null auf 100% angehoben wird. Dieser Effekt kann nicht auf der<br />
Titration eines einzelnen Aminosäurerestes zurückgehen (lineares Intervall entsprechend einer pH-<br />
Einheit) sondern entsteht durch eine Überlagerung verschiedener pH-Effekte, so z.B. der<br />
säureinduzierten Dissoziation in inaktive Untereinheiten.<br />
1 Die Einheit des Extinktionskoeffizienten folgt aus dem Lambert-Beerschen Gesetz, ε = E/c × d.<br />
Im deutschen Sprachraum wird manchmal noch die Konzentration in mol/cm 3 anzugeben. Daraus<br />
resultiert die Dimension (1/((mol/cm 3 × cm) bzw. cm 2 /mol. Im internationalen Schrifttum (und allen<br />
vorliegenden Ausführungen) wird die Konzentration in mol/l ausgedrückt, woraus als Dimension<br />
1/((mol/l) × cm), 1/((mmol/cm 3 ) × cm) bzw. cm 2 /mmol folgen.
22 Daten<br />
Abb. 2.5: Aktivitätsprofil der PFK in 50 mM Glycylglycin. Nach<br />
T. E. Mansur und C. E. Ahlfors (1968), J. Biol. Chem. 243, 2523-2533<br />
Ein signifikanter Insulineffekt ist die Anhebung des glycolytischen Metabolitenflusses. Offenbar durch<br />
Stimulierung des Na + /H + -'exchangers' der Zellmembran steigt der intrazelluläre pH-Wert innerhalb<br />
des Bereiches der PFK-Aktivierung. Hierbei hängt das konkrete pH-Intervall von der Konzentration<br />
der Substrate und allosterischen Aktivatoren ab (W. B. Busa und R. Nuccitelli, Am. J. Physiol. 246,<br />
R409, 1984).<br />
Für PFK-Enzyme verschiedener Organismen wurden insgesamt über 20 Effektoren<br />
identifiziert. Allosterische Aktivatoren sind AMP, F-6P, F-1.6BP, Mg ++ , K + und NH 4 + ,<br />
allosterische Inhibitoren sind ATP und Citrat 2) . In Gegenwart von Mg ++ katalysiert<br />
PFK die Bildung von F-1.6BP aus F-6P und ATP in einer praktisch irreversiblen<br />
Reaktion (die Rücküberführung von F-1.6BP in F-6P ist Aufgabe des Fluoridsensitiven<br />
Enzyms Fructose-bisphosphatase, EC 3.1.3.11).<br />
Neben diesen ATP-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferasen wurden, erstmals 1974, Pyrophosphat-Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferasen<br />
in Bakterien und Pflanzen beschrieben; sie sind<br />
dort die vorherrschende Phosphofructokinase (J. Biol. Chem. 249, 7737). Es handelt sich um eine<br />
Gruppe reversibel arbeitender Enzyme, die F-1.6BP aus F-6P und Pyrophosphat produzieren. In<br />
diesen Organismen liegt die Pyrophosphatkonzentration eine Größenordnung über dem K m -Wert. Die<br />
Aktivität dieser Glycolyseenzyme ist extrem abhängig vom Regulatormolekül F-2.6BP (K d = 2.8-5.5<br />
nM, Eur. J. Biochem. 129, 191, 1982, Physiol. Plant 92, 311, 1994).<br />
Struktur:<br />
(Biospektrum 5, 43-45, 1997)<br />
Der molekulare Aufbau/die Regulation der PFK hängen vom untersuchten<br />
Organismus und dort ggf. vom Gewebe ab:<br />
Hefe: Hetero-Oktamer (α 4 ß 4 mit M r 130k Untereinheiten). Genduplikation führte zunächst zu einem<br />
Fusionsprotein, weitere Genduplikation sodann zu α- und β-Untereinheiten. Jede Untereinheit besitzt<br />
in der N-terminalen Hälfte ein katalytisches Zentrum. In den C-terminalen Hälften entwickelten sich<br />
aus den (ursprünglich katalytischen) Bindungsstellen allosterisch regulierte Zentren.<br />
Muskel, Erythrozyten: Assoziation (= Aktivierung) abhängig von der Proteinkonzentration, der<br />
Konzentration an ATP/F-6P (senkt/fördert) sowie dem pH-Wert (alkalische pH-Werte fördern).Homobzw.<br />
Heterotetramere mit M r 340k Untereinheiten. Spezifische Aktivität bis zu 158 units/mg (J. Biol.<br />
Chem. 243, 2523-2533, 1968). Beim Menschen führt ein Defekt im Gen für die homo-tetramere<br />
Muskel-PFK zur Glykogenspeicherkrankheit "Taruiś disease". Die auf das Doppelte bis Dreifach<br />
2 "PFK1" wird in allen Geweben, in unterschiedlichem Ausmaß, reguliert durch<br />
- " energy charge" (ATP+0.5ADP/(AMP+ADP+ATP)) +/-<br />
- NADH -<br />
- G-1.6DP +<br />
- F-2.6BP ++ (!)<br />
- cAMP (via F-2.6BP) -<br />
- Citrat -
23<br />
Daten<br />
gesteigerte Glykogenkonzentration im Muskel führt zu Muskelleiden nach Anstrengung und zu<br />
hämolytischen Symptomen.<br />
Leber: Ein Vergleich mit dem Muskelenzym ergibt Unterschiede im regulatorischen Verhalten<br />
hinsichtlich ATP, (stärkere Inhibition), Citrat, PEP, Creatin-P, 2-PG, 3-PG (geringere Inhibition) sowie<br />
AMP und ADP (geringere De-inhibition). Die spezifische Aktivität beträgt 1/50 des obigen; vergl. J.<br />
Biol. Chem. 246, 245 (1971).<br />
3.3 Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12),<br />
Enzym des Schrittes 5<br />
M. Lazdunski Curr. Top. Cell. Reg. 5, 268 (1972), Worthington Enzyme Manual<br />
Prinzip: Die Vorwärtsreaktion der GAPDH beinhaltet drei Substrate (GAP, NAD + ,<br />
P i ). Die oxidative Phosphorylierung von GAP erfolgt in zwei Schritten. Im ersten<br />
Schritt reagiert der Aldehyd mit dem Cystein des aktiven Zentrums zum<br />
Hemithioacetal, welches zum Thioester-Intermediat oxidiert wird. Im zweiten Schritt<br />
wird das 3-Phosphoglycerol-Enzym phosphorolytisch zum BPG gespalten.<br />
Das Enzym liefert klassische "steady-state"-Kinetiken mit allen Substraten<br />
(einschließlich beider Oxidationsstufen des Coenzyms), jedoch sind die aktiven<br />
Zentren nicht unabhängig voneinander: sowohl NAD + als auch NADH,H + zeigen bei<br />
ihrer Bindung negative Kooperativität (Bode et al. 1975, Biochemistry 14, 1146). Wie auf Grund<br />
der tetrameren Struktur zu erwarten, bindet das Enzym vier Moleküle des<br />
Coenzyms, jedoch sind deren Bindungskonstanten weit voneinander verschieden.<br />
Die ersten beiden Moleküle werden so fest gebunden, dass ihre Dissoziationskonstante<br />
durch herkömmliche Verfahren nicht zu bestimmen ist, die folgenden<br />
beiden Moleküle zeigen geringere Affinitäten (d.h. höhere Dissoziationskonstanten).
24<br />
Daten<br />
An diesem Beispiel wurde erstmals das Phänomen der "negativen Kooperativität"<br />
beobachtet und analysiert.<br />
Struktur: M r = 144 000<br />
Vier identische Untereinheiten mit je M r 36k bzw. 330 Aminosäuren. Im Polypeptid<br />
am aktiven Zentrum gibt es zwei Thiole, eines mit außergewöhnlicher Reaktivität.<br />
Die Coenzymbindung hängt ferner mit einem reaktiven Lysinrest zusammen.<br />
Physikalische Daten des Apoenzyms:<br />
Kaninchenmuskel: E 280 1% = 8.15; E 280 /E 260 = 2.2; pH I = 8.2<br />
Hefe: E 280 1% = 8.6; E 280 /E 260 = 2.15<br />
Aktivatoren:<br />
EDTA, Cystein, DTT als Thiol-Schutzreagentien, NAD +<br />
Dissoziation/Proteolyse<br />
Inhibitoren:<br />
als Stabilisator gegen<br />
Alle Agenzien, die die Oxidation des reaktiven Thiols fördern. Schwermetallionen,<br />
pCMB, IA, o-Iodosobenzoat. ATP und cAMP als kompetitive Inhibitoren fördern die<br />
Dissoziation.<br />
Michaelis-Konstanten [mM] bei pH 8.5, 25 o für das Muskelenzym (K. D. Kulbe<br />
(1969), Dissertation, Universität Hannover)<br />
GAP NAD + Phosphat Arsenat<br />
0.05 0.04 0.3 0.07<br />
3.4 Pyruvatkinase Enzym des Schrittes 9<br />
Literatur: Worthington Enzymes; F. J. Kayne in “The Enzymes”, P.D. Boyer ed., pp353<br />
Prinzip: PK ist ein Schlüsselenzym im Glycogen-Katabolismus, das ATP durch<br />
Gruppenübertragung von PEP erzeugt. Substrate sind neben ADP auch GDP, IDP,<br />
dADP, UDP, CDP und dCDP. Größere Spezifität besteht hinsichtlich des<br />
Phosphatdonors.<br />
Besonderes Interesse besteht an genetischen Varianten, die in Verbindung mit ererbten Anämien<br />
gebracht werden. Im Anabolismus (Gluconeogenese) wird die Überführung von Pyruvat in PEP über<br />
Pyruvatcarboxylase und PEP-Carboxykinase erzielt, so dass an diesen Stellen regulatorische<br />
Enzyme zu erwarten sind.<br />
Eigenschaften: PK (M r = 237k) ist ein tetrameres Enzym aus vier identischen Untereinheiten<br />
mit je M r = 57k. Die Dissoziation zu Dimeren ist möglich. Erstes<br />
beschriebenes Enzym mit absoluter Erfordernis für monovalentes Kation (K + ). Die<br />
Aktivität hängt ferner von Mg ++ ab; für beide Kationen sind spezielle Bindungsplätze<br />
vorhanden und dem [Mg ++ ] wird regulatorische Bedeutung beigemessen. Falls [ATP]<br />
> [Mg ++ ], wird eine Inhibition gemessen. Kann dies ein physiologisch bedeutsamer<br />
Mechanismus sein? Die Bindung beider Kationen erfolgt mit leichter Kooperativität.
25<br />
Daten<br />
Der K + Effekt ist strikt mit dem des F-1.6BP gekoppelt, das als ´feedforward́-Aktivator<br />
fungiert und Kooperativität für PEP (aber nicht für ADP) hervorruft.Dieser<br />
Mechanismus gilt als ein wichtiger Schalter für den Übergang der Gluconeogenese<br />
zur Glycolyse.<br />
Das Enzym wird auch in vivo durch ATP inhibiert. Dessen Kompetition mit<br />
ADP und PEP läßt einen gemeinsamen Phosphatbindungsplatz vermuten. Phe<br />
wurde als nichtkompetitiver Inhibitor beschrieben und zwar mit Hill-Koeffizienten die<br />
zwischen pH7 und 8 von 0.85 auf 2 steigen PK war übrigens das erste Protein, für<br />
welches ligandeninduzierte Konformationsänderungen durch Trp-Differenzspektren<br />
nachgewiesen wurden.<br />
3.5 Lactatdehydrogenase, Enzym des Schrittes 12<br />
Lexikon Biochemie, 2. Auflage 1982, Verlag Chemie<br />
Prinzip: LDH, Benannt nach der thermodynamisch ungünstigen Rückreaktion des<br />
Substrates Milchsäure (Lactat) zu Pyruvat. Absolut spezifisch für L(+) Lactat. Die<br />
höchsten LDH-Aktivitäten weisen Herzmuskel und Leber auf. Da das Enzym ein<br />
Tetramer aus vier 35k Untereinheiten ist, treten organspezifisch fünf isomere<br />
Isoenzyme aus der M- bzw. der H-Kette auf (Kapitel 8.10). Die Isoenzyme lassen<br />
sich aufgrund verschiedener pH I -Werte elektrophoretisch trennen, wobei das H 4<br />
Enzym am stärksten negativ geladen ist. Für das 'tuning' der Glycolyse und des<br />
Citratcyclus ist die unterschiedliche Regulation durch Pyruvat und NAD + wichtig, zum<br />
analytischen Nachweis dient vereinfachend die unterschiedliche Hemmbarkeit durch<br />
Pyruvat-Analoge (Kapitel 8.10). Die H 4 und H 3 M-Formen sind ferner extrem<br />
thermolabil (Inaktivierung durch 5 Min bei 65 o ).<br />
LDH dient zur Diagnose des Herzinfarktes und der Hepatitis, da bei diesen<br />
Krankheitsbildern der Serumgehalt des entsprechenden Isoenzyms stark erhöht ist.<br />
Gereinigte LDH dient im gekoppelten optischen Test zur Messung anderer<br />
Enzymaktivitäten wie PK, Enolase, Transaminasen, sowie zur enzymatischen<br />
Bestimmung zahlreicher Metabolite wie ADP, ATP, L(+)-Lactat und Pyruvat.<br />
Enzykinetische Daten:<br />
Enzym Rind-H 4 Hühner-H 4 Rind-M 4 Hühner-M 4<br />
K m (Pyruvat) 1.4E-4M 8.9E-5M 1E-3M 3.2E-3M<br />
Turnover No. 49400 45500 80200 93400
26<br />
Aktivitätstests<br />
4. AKTIVITÄTSTESTS: GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN<br />
4.1 Einleitung zu den Versuchen<br />
Die Enzymmenge in Lösung oder einem Gewebeextrakt kann über eine geeignete<br />
Umsetzungsreaktion quantitativ bestimmt werden. Diese Messung erfordert Kenntnis<br />
über:<br />
- die Stöchiometrie des Umsatzes<br />
- die Gleichgewichtslage der Reaktion (Kapitel 5)<br />
- die Erfordernis von Cofaktoren (Metallionen, Coenzyme)<br />
- die K m -Werte für Substrat(e) und Cofaktoren (Kapitel 8)<br />
- das pH-Optimum<br />
- ein möglichst direkter, einfacher Assay, basierend auf dem Verschwinden<br />
des Substrates ("[S]-Fall") oder Entstehen des Produktes<br />
("[P]-Fall")<br />
- die thermische Stabilität bei der Temperatur des Assays<br />
Wann immer möglich, erfolgt der Test bei Substrat- und Cofaktorsättigung<br />
(Reaktionsordnung 0, bezogen auf Substrat), am optimalen pH-Wert und bei 25 o C.<br />
Unter diesen Bedingungen hängt die Reaktions-Anfangsgeschwindigkeit nur von der<br />
Enzymkonzentration ab (vergl. Kapitel 2.4 und Abb. 4.1B) 3 .<br />
Die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umsetzung ergibt sich durch die Steigung<br />
der Tangente an den Ursprung (t=0, P=0), denn nur hier entspricht die<br />
Substratkonzentration noch dem eingesetzten Wert [So]. Das korrekte Legen einer<br />
Tangente ist für den Experimentator die Hauptschwierigkeit bei enzymkinetischen<br />
Messungen und bestimmt häufig den Ausgang des Versuchs (vergl. Abb. 4.1 und Kap. 9).<br />
Um hier die Willkür etwas zu nehmen, wurde das Programm V0 entwickelt, das die<br />
enzymatische Umsetzung aufgrund der integrierten Michaelis-Menten Beziehung<br />
nachvollzieht und hieraus die Anfangssteigung errechnet.<br />
Zumeist ist die Messung der Produktentstehung ("[P]-Fall") genauer durchzuführen<br />
als die des Substratumsatzes (["S-Fall"), denn bei Sättigung stellt sich letztere als<br />
kleine Differenz großer Werte dar. Reaktionsprodukte misst man durch Trennverfahren,<br />
chemische Nachweisverfahren, spektroskopische oder fluorimetrische<br />
Messungen. Die spektroskopischen Verfahren ermöglichen eine kontinuierliche<br />
Registrierung des Substratumsatzes und sind - wenn anwendbar - immer<br />
vorzuziehen.<br />
3 hier ist sicherzustellen, dass das Enzym nicht das durchaus gängige Phänomen einer "<br />
Substratinhibition" (Verlangsamung des Umsatzes bei sehr hohen Substratkonzentrationen<br />
durch Besetzung sekundärer Bindungsplätze) zeigt.
27<br />
Aktivitätstests<br />
Abb. 4.1: Zeit-Umsatzkurven enzymkatalysierter Reaktionen ("[P]-Fall").<br />
A- Die Anfangssteigung ergibt sich entweder durch Zeichnen einer Tangente an den Ursprung oder durch Kurvenanpassung<br />
(Kap. 9 und Abb. 4.2). Die Graphik zeigt, wie aus der źero-time tangent́ der Substratumschlag je Minute (für [So], d.h. die<br />
vorgelegte Substratkonzentration) aus der Produktentstehung (ṕroduct/miń) abzuleiten ist. Hat der Schreiber die<br />
vorgeschlagene Grundeinstellung, so entspricht 1 min einem Vorschub von 6 cm (1mm/sec).<br />
B - Invertase-katalysierter Umsatz für Saccharose-Konzentrationen von 5.2 mM bis 333 mM; nach Michaelis und Menten (1913).<br />
Ordinatenwerte hier: optische Drehung, proportional zur Produkt (Glucose- plus Fructose-) Konzentration. Abszisse: Zeitachse<br />
(min). Weitere Auswertung: siehe Abb. 8.1B.<br />
Abb. 4.2: Konstruktion einer Tangente an den Ursprung aus der im Programm "V0" erhaltenen<br />
Anfangssteigung (Vo = 21.4). In diesem Fall entspricht 1 Einheit auf der x-Achse 21.4 Einheiten auf der<br />
y-Achse<br />
Nach internationaler Vereinbarung definiert man die Einheit ("unit") enzymatischer Aktivität<br />
als jene Menge des Proteins, die unter optimalen Reaktionsbedingungen, jedoch bei 25 o ,1<br />
µMol Substrat je Minute umsetzt (alternative Definitionen: Kapitel 4.10.1). Die spezifische
28<br />
Aktivitätstests<br />
Aktivität sind dann die Enzymeinheiten je Masseneinheit [mg] an Protein; dies ist gleichzeitig<br />
ein nützliches Reinheitskriterium, welches hilft, den Fortgang von Reinigungsoperationen zu<br />
beurteilen. ́τ́, die ́ turnover numbeŕ (auch " Wechselzahl", " molare Aktivität" oder kcat)<br />
bezeichnet die Zahl der Substratmoleküle, die je Zeiteinheit (zumeist: Sekunde) von einem<br />
Enzymmolekül umgeschlagen wird. Die turnover number von Enzymen kann über viele<br />
Größenordnungen schwanken; das aktivste bisher beschriebene Enzym ist Carbonsäureanhydratase<br />
(100 000 Substratmoleküle je Sekunde; 10 7 fach beschleunigt gegenüber<br />
der unkatalysierten Reaktion).<br />
4.2 Versuch A0: Präparation des Muskelextraktes<br />
5 g gefrorener Kaninchenmuskel werden im Virtis-Homogenisator in<br />
1) 100 ml EDTA (50 mM) pH 8.4 (mit NaOH)<br />
zerkleinert. Man zentrifugiert das Homogenat (SS34 Rotor, 10000 Upm, 5 min), bestimmt den<br />
Proteingehalt des Überstandes nach einem geeigneten Verfahren (Kapitel 1.2), verdünnt ihn<br />
mit 1) im Verhältnis 1:10 und führt an dieser Lösung die Enzymtests A1.1-A7.3 durch. Dabei<br />
sind sowohl die Gesamtaktivitäten einer Reaktionskette (Aldolase-TIM-GAPDH bzw. PGK-<br />
GAPDH) zu messen als auch die Einzelaktivitäten durch Zusatz geeigneter Hilfsenzyme (vgl.<br />
Kapitel 2.1). Durch einen Vergleich der Volumenaktivitäten soll bei gekoppelten Tests jenes<br />
Enzym ermittelt werden, welches die jeweilige Reaktionskette limitiert.<br />
4.3 Versuch A1.1: Aktivitätstest für Lactat-Dehydrogenase: "Vorwärtsreaktion" 4<br />
Obgleich dieses Enzym nach seiner Fähigkeit benannt worden ist, Milchsäure zu<br />
Brenztraubensäure (pyruvic acid) zu oxidieren, ist beim glycolytischen Enzym das<br />
Gleichgewicht so sehr in Richtung der Milchsäurebildung verschoben, dass die Mehrzahl der<br />
Testverfahren auf diesem Vorgang beruhen. Dies ist die zweite Stelle im Glycolyse-Schema,<br />
an dem mit Vorteil der optische Test angewendet werden kann (d.h., Registrierung des mit<br />
der NADH, H + -Umsetzung verbundenen Abfalls der E 340 ).<br />
Substanzen:<br />
1) Puffer:0.03 M Na-phosphat, pH 7.4<br />
(hergestellt durch Mischen von 0,03 M NaH 2 PO 4 und 0.03 M Na 2 HPO 4 oder durch NaOH-Titration von<br />
einer konzentrierteren NaH 2 PO 4 -Lösung, die dann auf ihr Endvolumen gebracht wird)<br />
2) 50 mM Na-pyruvat<br />
3) 4.8 mM NADH<br />
4 Als "Vorwärtsreaktion wird in diesem Praktikum die Reaktionsrichtung in der Glycolyse definiert.<br />
Schreibergeschwindigkeit für alle Kinetiken: 60 mm/min d.h. 1 mm/s (geräteabhängiger<br />
Richtwert)
29<br />
Aktivitätstests<br />
Man versetze 2.7 ml Testpuffer (1) mit 100 µl glycolytischer Lösung und eiche das<br />
Spektralphotometer auf E 340 = 0. Nach Zusatz von 100 µl NADH kann die Reaktion<br />
durch 100 µl Na-pyruvat (2) gestartet werden. Aus der Anfangsgeschwindigkeit der<br />
Reaktion errechne man die Volumenaktivität an LDH [µmol/ml Lösung x min] sowie<br />
die spezifische Aktivität der Lösung [µMol/mg Protein x min]. Siehe das<br />
Rechenbeispiel, Kap. 4.10.<br />
4.3.2 Versuch A1.2: Aktivitätstest für Lactat-Dehydrogenase:<br />
"Rückwärtsreaktion"<br />
Literatur: I. Gutmann in "Methoden der enzymatischen Analyse II (1974), H.U. Bergmeyer Hrsg., pp.<br />
1510, Verlag Chemie<br />
Lactat-Dehydrogenase katalysiert die Reaktion<br />
deren Gleichgewicht weit auf der linken Seite liegt (K = 4x10 -5 für 25 o C und pH 7). Zur<br />
quantitativen Dehydrierung von Lactat müssen die Reaktionsprodukte aus dem<br />
Gleichgewicht abgefangen werden. Protonen werden durch ein alkalisches<br />
Reaktionsmedium gebunden, Pyruvat wird als Hydrazon abgefangen. Somit lautet die<br />
Gleichung:<br />
Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion beträgt bei 25 o und pH 9,5 etwa 0.1.<br />
Substanzen:<br />
1) Puffer: 0.34 M Hydrazin 5<br />
0.45 M Glycin, pH 9,5<br />
2) 30 mM NAD +<br />
3) 50 mM Lactat<br />
4) Vergleichspuffer: 0.45 M Glycin, pH 9,5<br />
5) 4.8 mM NADH (aus A1.1)<br />
6) 50 mM Na-Pyruvat.<br />
Man fülle eine QS-Küvette mit 2.7 ml des Puffers 1, gebe 100 µl der konzentrierten<br />
glycolytischen Lösung zu und eiche das Photometer auf E 340 = 0. Enthält der<br />
5 Vorsicht: Hydrazin wird heute als Carcinogen eingestuft
30<br />
Aktivitätstests<br />
Muskelextrakt bereits Lactat, so ist nach Zusatz von 100 µl NAD + ein leichter Anstieg<br />
der E 340 zu verzeichnen (bitte notieren für spätere Kalkulationen, vgl. Versuchsgruppe<br />
B). Anschließend startet man den Aktivitätstest durch Zupipettieren von 100 µl Lactat-<br />
Lösung und registriert den Anstieg der E 340 .<br />
Zusatzversuch: (Zur Gleichgewichtslage der LDH-Reaktion)<br />
Man führe einen analogen Versuch für die Aktivität der LDH in der Vorwärtsreaktion<br />
durch, d.h., man verwende statt der Lösungen (1), (2) und (3) die Lösungen (4), (5)<br />
und (6). Falls die Reaktion unter diesen Bedingungen für eine Registrierung zu schnell<br />
abläuft, ist der Muskelextrakt zu verdünnen und der Verdünnungsfaktor zu notieren:<br />
die enzymatische Aktivität ist eine Funktion der Enzymkonzentration.<br />
- Wie ist das Verhältnis der Aktivitäten (d.h. Anfangsgeschwindigkeiten) für<br />
die Vorwärts-/Rückwärtsreaktion bei pH 9,5?<br />
- Wie hoch ist der Endwert der E 340 in der Rückwärtsreaktion bei<br />
Verwendung von Puffer (4) statt Puffer (1)? (Bitte notieren für spätere<br />
Auswertung in Versuchsgruppe B).<br />
4.4 Versuch A2: Kombinierter Test für PGK und GAPDH (Rückwärtstest)<br />
Die Reaktionen von GAP zu BPG und 3-PG sind reversibel und können, z.B. durch<br />
Anwendung eines großen ATP-Überschusses in Richtung der GAP-Bildung gelenkt<br />
werden. Läßt man Muskelextrakt unter Zusatz von ATP und NADH,H + auf 3-PG<br />
einwirken, so ist, bei Gegenwart von PGK und GAPDH eine Oxidation des NADH,H +<br />
zum NAD + zu verzeichnen. Dieser Prozeß läßt sich am Absinken der E 340 verfolgen<br />
(optischer Test, s. Kapitel 2.4).<br />
Substanzen:<br />
1) Testmischung: 1 mM EDTA<br />
8 mM MgSO 4<br />
80 mM TRA-HCl, pH 7.6, dann<br />
12 mM 3-PG<br />
2) 4.8 mM NADH<br />
3) 75 mM ATP<br />
4) für Einzeltests: Hilfsenzym 6 (je 5 µl Kristallsuspension, s. Fußnote).<br />
Man fülle eine QS-Küvette mit 2.7 ml Testmischung und setze 100 µl Muskelextrakt<br />
zu. Man stelle das Spektralphotometer auf 340 nm und justiere mit der angegebenen<br />
Mischung den Nullpunkt (E 340 = 0). Sodann setze man 100 µl NADH,H + -Lösung zu<br />
6Hilfsenzyme sind bei der gegebenen Aufgabenstellung jeweils für Einzeltests nötig. Beispiele:<br />
Versuch<br />
A2:Hilfsenzym PGK zum GAPDH-Test und vice versa<br />
A3:Hilfsenzym Aldolase zum GAPDH-Test und vice versa<br />
A5:Hilfsenzym TIM zum Aldolasetest
31<br />
Aktivitätstests<br />
(Endkonzentration 0.16 mM NADH,H + , d.h. E 340 = 1). Man starte die Reaktion durch<br />
Zugabe von 100 µl ATP-Lösung und registriere den Abfall der E 340 . Aus der<br />
Anfangsgeschwindigkeit dieser Reaktion errechne man die Volumenaktivität sowie die<br />
spezifische Aktivität. (Siehe das Rechenbeispiel in Kapitel 4.10).<br />
4.5 Versuch A3: Kombinierter Test für Aldolase und GAPDH<br />
Der optische Test der Aldolase setzt die Verfügbarkeit zweier Hilfsenzyme, TIM und<br />
GAPDH voraus; er arbeitet auch in Gegenwart von nur GAPDH, basiert dann aber nur<br />
auf der Umsetzung des Nebenproduktes der Aldolspaltung, GAP.<br />
Substanzen:<br />
1) Testmischung: 5 mM Dithiothreitol (DTT)<br />
0.36 mM EDTA<br />
65 mM Tris-HCl, pH 7.4<br />
2) 0.48 M Na 2 HAsO 4<br />
3) 30 mM NAD +<br />
4) 25 mM F-1,6-BP<br />
5) ggf. Hilfsenzyme 6) (je 5 µl Kristallsuspension).<br />
Man versetze 1.7 ml der Testmischung nacheinander mit 1 ml F-1,6-BP (4), 100 µl<br />
glycolytischer Lösung und 100 µl Na 2 HAsO 4 (2). Das Photometer wird mit dieser<br />
Mischung auf E 340 =0 geeicht. Durch Zugabe von 100 µl NAD + (3) kann die<br />
enzymatische Reaktion gestartet und durch Messung der E 340 verfolgt werden.<br />
Auswertung wie zuvor.<br />
4.6 Versuch A4:Aktivitätstest für Aldolase (Hydrazonbildung, zur Zeit nicht durchgeführt)<br />
Falls ein "UV-fähiges" Photometer zugänglich ist: Ein Testverfahren, das unabhängig von Hilfsenzymen ist, beruht darauf, dass<br />
GAP und DAP, die Produkte der enzymatischen Reaktion, mit Hydrazin (vergl. Fußnote 5 ) zu den entsprechenden Hydrazonen<br />
umgesetzt werden können. Dieser Folgeschritt verschiebt das Gleichgewicht der enzymatischen Reaktion ganz auf die Seite der<br />
Triosephosphate:<br />
Die Entstehung des GAP-Hydrazons kann dabei durch seine Lichtabsorption bei 240 nm verfolgt werden.<br />
Eine Einheit enzymatischer Aktivität ist hier willkürlich definiert als eine Extinktionsänderung ∆E 240 = 1 je min. Welche Angabe<br />
wäre erforderlich, um die Aktivität nach internationaler Vereinbarung in (µmol GAP/min . mg Aldolase) darstellen zu können?<br />
Substanzen:<br />
1) Substrat: 25 mM Fructose-1,6-diphosphat in H 2 O, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung)<br />
2) Reagenz: 3.5 mM Hydrazin-Sulfat in 0.1 mM EDTA, pH 7.5 (eingestellt mit verdünnter Ammoniaklösung).<br />
Man fülle eine QS-Küvette nacheinander mit 500 µl Substrat (1), 2 ml Reagens (2) und 500 µl H 2 O, eiche mit dieser Mischung
32<br />
Aktivitätstests<br />
das Photometer auf E 240 = 0 und verfolge während einiger Minuten den leichten, unspezifischen Anstieg der E 240 in der<br />
Testküvette (sog. "non-enzymatic rate", d.h. spontane Aldolspaltung). Sodann versetze man die Testküvette mit 100 µl der glycolytischen<br />
Lösung (s. oben) und registriere den nun erfolgenden Anstieg der E 240 ; die Eigenabsorption des Zusatzes bei 240 nm ist<br />
zu berücksichtigen. Nach Abzug der "nonenzymatic rate" von der "enzymatic rate" kann nun die Volumenaktivität (units/ml)<br />
errechnet werden. Bei der endgültigen Definition der Startextinktion ist die Eigenextinktion der glycolytischen Lösung zu berücksichtigen<br />
Anmerkung: dieser Versuch dient der Demonstration eines Aktivitätstests, der nicht auf dem optischen Test beruht. Bei<br />
Schwierigkeiten in der Durchführung bediene man sich eines "UV-fähigen" Photometers, ggf. sogar eines gereingten Enzyms<br />
4.7 Versuch A5:Kombinierter Test für Aldolase und Triose-P-Isomerase (TIM)<br />
Der Test beruht auf einem Hilfsenzym, welches Glycolyse und Fettsynthese koppelt,<br />
d.h., DAP reduziert: Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase.<br />
Substanzen:<br />
1) Testmischung von Versuch A3.<br />
2) 25 mM F-1,6-BP von Versuch A3.<br />
3) 4.8 mM NADH,H + von Versuch A2.<br />
4) Hilfsenzyme 6) je 5 µl Kristallsuspension.<br />
Man versetze 1.7 ml der Testmischung (1) nacheinander mit 1 ml F-1,6-BP, 5 µl<br />
Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase und 100 µl NADH,H + (3). Zusatz von 100 µl<br />
glycolytischer Lösung leitet die Reaktion ein. Bei Verwendung als Aldolasetest ist TIM<br />
als Hilfsenzym einzusetzen.<br />
- Der Test eignet sich schlecht zur Bestimmung der TIM-Aktivität. Warum?<br />
- Stimmt die Aldolaseaktivität mit der unter A3 ermittelten überein? Würden<br />
Sie dies erwarten?<br />
4.8 Versuch A6:Aktivitätstest für Triosephosphat-Isomerase (TIM)<br />
Die Anordnung ist ähnlich wie in A5, benutzt jedoch GAP als Substrat.<br />
Substanzen:<br />
1) Testmischung von Versuch A3<br />
2) D-GAP, ca. 7.5 mM<br />
3) 4.8 mM NADH,H + von Versuch A2<br />
4) Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Kristallsuspension).<br />
Man versetze 2.7 ml der Testmischung (1) nacheinander mit 5 µl der Kristallsuspension<br />
(4), 100 µl GAP (2) und 100 µl NADH,H + (3). Ein eventuelles Absinken<br />
des E 340 -Wertes zu diesem Zeitpunkt ist ein Maß für die spontane Umwandlung von<br />
GAP zu DAP (kontrollieren!). Zusatz von 100 µl glycolytischer Lösung wird das
33<br />
Aktivitätstests<br />
Absinken der E 340 beschleunigen und ist (nach eventueller Korrektur) ein Maß der<br />
TIM-Aktivität.<br />
4.9.1 A7.1: Darstellung des GAPDH-Substrates (GAP)<br />
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe. Wird durch die Assistenten erledigt.<br />
Prinzip: Es soll aus einer chemisch stabilen Vorstufe, dem Bariumsalz der D,L-Glycerinadehyd-3-Phosphorsäure (GAP-R) das<br />
instabile Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) gebildet werden. Austausch der Ba 2+ -Ionen und Zerlegung des (säurelabilen) Acetals<br />
erfolgen in einem Schritt an einem Kationenaustauscher (Dowex-50 W-Harz).<br />
Substanzen: 1) Dowex-50-Ionenaustauscher (H + -Form); 2) D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat-diäthylacetal, Ba ++ -Salz (GAP-R).<br />
In einem Zentrifugierglas werden 7,5 g Dowex-Harz und 500 mg GAP-R in 25 ml H 2 O suspendiert. Unter ständigem Schütteln<br />
wird die Suspension 3.0 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt, wobei GAP in Lösung geht. Man kühlt das Gemisch im<br />
Eisbad, zentrifugiert und entfernt GAP vom Harz durch Dekantieren. Um eine möglichst vollständige Extraktion des GAP aus dem<br />
Harz zu erreichen, wird letzteres mindestens noch einmal in je 2 ml H 2 O suspendiert und zentrifugiert. Die Überstände werden<br />
vereinigt.<br />
Wird diese Vorschrift genauestens eingehalten, so enthalten die vereinigten Überstände mindestens 150 µmol D,L-GAP (d.h., 75<br />
µmol des natürlichen, D-konfigurierten) Isomers. Die Lösung ist für mindestens vier Tage völlig stabil; Gefrieren erhöht die<br />
Lebensdauer beträchtlich und wird empfohlen.<br />
4.9.2 Versuch A7.2: Standardisierung der GAP-Lösung (enzymatisch)<br />
Prinzip:<br />
Erfaßt wird nur das D-Isomer des GAP. Näheres zum optischen Test unter 2.4.<br />
Substanzen:<br />
1) 0.2 M Tris-HCl, pH 8.5<br />
2) 0.17 M Na 2 HAsO 4<br />
3) 0.2 M L-Cystein<br />
4) 0.6 M NaF<br />
5) 0.02 M NAD +<br />
6) GAPDH-Lösung mit 750 µg Protein je ml (einstellen gemäß Kapitel 1.2.1)<br />
In eine Küvette pipettiert man: 1.5 ml Tris-HCl Puffer, 300 µl Na 2 HAsO 4 , 300 µl H 2 O,<br />
50 µl Cystein, 600 µl NaF, 100 µl GAPDH und 100 µl GAP. Man schreibt die Nullinie<br />
und startet die Reaktion durch Zugabe von 50 µl NAD + . Endvolumen: 3ml.<br />
Achtung: durch erhebliche Instabilität von verdünntem GAP ist es erforderlich, die Reaktion bald nach<br />
GAP-Zugabe zu starten.<br />
Kalkulation: E 340 x 3/6.3 = µmol GAP in Küvette 1, d.h., in 100 µl der zu<br />
standardisierenden GAP-Lösung. 7<br />
7 Die Richtigkeit dieses Ansatzes folgt am einfachsten aus folgenden Überlegungen:
34<br />
Aktivitätstests<br />
4.9.3 Versuch A7.3: Aktivitätstest für GAPDH<br />
Zur Vorbereitung der Versuche der B-Gruppe (nicht am 1. Praktikumstag)<br />
Prinzip: vergl. Kapitel 2.1<br />
Substanzen:<br />
1)Testpuffer: 40 mM Triäthanolamin<br />
50 mM Na 2 HPO 4<br />
0.2 mM EDTA, pH 8.5 (HCl)<br />
2) 7.5x10 -3 M NAD +<br />
3) 7.5x10 -3 M D-GAP<br />
4) GAPDH mit einer Protein-Konzentration von 200 µg/ml (Ermittlung gem. Kapitel<br />
1.2.1)<br />
Man fülle eine Küvette wie folgt:<br />
1) Testpuffer 2.7 ml<br />
2) GAP 8 0.1 ml<br />
3) GAPDH 100 µl<br />
Man läßt diese Mischung einige Minuten äquilibrieren, justiert das Photometer auf<br />
E 340 =0 und startet die Reaktion durch Zugabe von 0.1 ml NAD + . Der Wert ∆E 340 je min<br />
ergibt sich dann aus der Reaktions-Anfangsgeschwindigkeit.<br />
Nur wenn NAD + und GAP in sättigender Konzentration vorliegen (überprüfen!), ist<br />
v proportional der spezifischen Aktivität des Enzyms:<br />
spez. Akt. = v [µmol NAD + /(min×mg Enzym)]<br />
Die spezifische Aktivität wird in sog. "enzyme units" angegeben (Definition Kapitel<br />
4.10). Ist Substratsättigung nicht zu erreichen, so ist, bei Kenntnis der K m -Werte von<br />
NAD + und GAP, die folgende Korrektur anzubringen (Biochem. J. 92, 578 (1964)):<br />
- bei einer (angenommenen) End-extinktion von 1.6 ergibt die Kurzformel<br />
1.6 × (3/6.3) = 0.76 µmol GAP in 100 µl<br />
7.6 µmol GAP in 1 ml<br />
7.6 mmol GAP in 1 l;<br />
Sie haben also eine 7.6 mM Lösung angesetzt, die in etwa den Erwartungen entspricht.<br />
- Gegenprobe: Zur Standardisierung wird die gewünschte 7.5 × 10 -3 M Stammlösung 100:3000<br />
verdünnt. Das ergibt eine 2.5 × 10 -4 M Küvettenfüllung.<br />
1 mol/l -> ∆E = 6300<br />
2.5 . 10 -4 mol/l -> ∆E = 1.58<br />
8 Man vergegenwärtige sich, dass die Endkonzentrationen von NAD + und GAP in der Küvette 7.5x10 -<br />
3 x100/3000 = 0.25x10 -3 M (0.25 mM) betragen.
35<br />
Aktivitätstests<br />
spez. Akt.<br />
S: Konzentrationen an NAD + bzw. GAP.<br />
= v . (1 + K m /S) NAD+ × (1 + K m /S) GAP<br />
4.10 Rechenbeispiel zu Aktivitätsbestimmungen: Volumenaktivität und<br />
spezifische Aktivität<br />
4.10.1 Definitionen<br />
Derzeit gibt es zwei Systeme zur Benennung von Enzymaktivitäten:<br />
- Die 1961 eingeführte "enzyme unit", definiert als diejenige Enzymmenge, die<br />
unter Standardbedingungen je min ein µmol Substrat umsetzt (dies ist die hier<br />
verwendete Definition. Es gibt Anzeichen dafür, dass sie sich bei Enzymologen<br />
halten wird).<br />
- Die 1972 definierte SI-Einheit "katal" (Symbol "kat"), das ist die Enzymaktivität,<br />
ausgedrückt als mol umgesetztes Substrat je sec.<br />
Die beiden Systeme sind folgendermaßen miteinander gekoppelt:<br />
1 kat = 6 × 10 7 enzyme units<br />
1 enzyme unit = 16.67 × 10 -9 kat<br />
= 16.67 nkat.<br />
4.10.2 Rechnung<br />
Aus dem Lambert-Beerschen Gesetz<br />
E = ε × c × d<br />
folgt für 1 cm-Küvetten (d = 1)<br />
E/ε = c<br />
d.h. aus der Extinktion E einer Substanz und über den Proportionalitätsfaktor ε<br />
(molarer Extinktionskoeffizient) lässt sich ihre molare Konzentration ermitteln. (Einheit:<br />
mol/l / mmol/ml).<br />
Analog lässt sich aus einer Kinetik, d.h. der Extinktionsänderung ∆E, der<br />
Substratumschlag ∆S während eines Zeitintervalls bestimmen:<br />
∆E/ε = ∆c<br />
NADH,H + hat einen molaren Extinktionskoeffizienten ε 340 = 6300. Bildung von 1<br />
mol/l (1 mmol/ml) wäre also mit einer Änderung der Extinktion, ∆E 340 = 6300<br />
verbunden. Angenommen, bei einem Aktivitätstest findet man eine Änderung der<br />
∆E 340 = 1,8 je min, so entspricht dies:<br />
1.8/6300 = 2.86 x 10 -4 mmol/(ml . min)<br />
d.h., einer Volumenaktivität von 0.286 µmol/(ml . min) oder (gebräuchlicher) 0.286<br />
enzyme units pro ml Lösung in der Küvette. Die Aktivität im Ausgangsextrakt ergibt<br />
sich dann durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor (30 für einen Prototyp-
36<br />
Aktivitätstests<br />
Ansatz, in dem 100 µl Extrakt auf 3 ml aufgefüllt werden; 30 × 0.268 = 8.04 enzyme<br />
units pro ml Ausgangsextrakt)<br />
Man hat ferner bestimmt, dass der Ausgangsextrakt 3 mg Protein je ml enthält.<br />
Daraus folgt dass 8.04 enzyme units auf 3 mg Protein zurückgehen, was einer<br />
spezifischen Aktivität von<br />
8.04 ÷ 3 = 2.86 enzyme units pro mg Protein<br />
entspricht<br />
Sollten immer noch Schwierigkeiten beim Nachvollziehen dieser Kalkulationen auftreten, so kann zur<br />
Unterstützung das Programm "Activity" herangezogen werden, dem dieser Rechengang zugrunde<br />
liegt.
37<br />
Standardenthalpie<br />
5. ZUR FREIEN STANDARDENTHALPIE (∆G o ) UND FREIEN ENTHALPIE (∆G)<br />
CHEMISCHER REAKTIONEN<br />
5.1 Einleitung zu den Versuchen<br />
Die Änderung der freien Enthalpie, ∆G, einer enzymatischen Umsetzung des Typs<br />
aA + bB __ > cC + dD<br />
lautet:<br />
c<br />
o C ⋅ D<br />
∆G = ∆G + RT⋅ln [ ] [ ]<br />
a<br />
[ A] ⋅[ B]<br />
Hierin sind [A] bis [D] die molaren Konzentrationen der entsprechenden Metabolite<br />
und a bis d ihre Stöchiometrien. R steht für die Gaskonstante {R=8.31434 . 10 -3<br />
[kJ/(mol . grd)], früher: R=1.98717 . 10 -3 [kcal/(mol . grd)]}, T die absolute Temperatur<br />
(zumeist 298 K entsprechend 25 o C) und ∆G o die noch abzuleitende freie<br />
Standardenthalpie. 9<br />
Die Gleichgewichtseinstellung der Reaktion folgt bei beliebigen Ausgangskonzentrationen<br />
[A] bis [D] dem Kriterium minimaler freier Enthalpie. Im Gleichgewicht<br />
ändert sich ∆G definitionsgemäß nicht mehr und mit ∆G=0 wird erhalten:<br />
d<br />
b<br />
c d<br />
c<br />
o C ⋅ D<br />
o C ⋅ D<br />
0 = ∆G<br />
+ RT⋅ln [ ] [ ] ∆G<br />
=−RT<br />
a b<br />
a<br />
[ A] ⋅[ B] ; ln[ ] [ ]<br />
[ A] ⋅[ B]<br />
Mit der aus dem Massenwirkungsgesetz folgenden Definition der Gleichgewichtskonstanten,<br />
K = ([C] c [D] d )/([A] a [B] b ) ergibt sich vereinfachend<br />
d<br />
b<br />
∆G o =−RT ln K<br />
Hierdurch wird illustriert, dass sich ∆G o<br />
prinzipiell aus der entsprechenden<br />
Gleichgewichtskonstanten bei derselben Temperatur ermitteln läßt. Somit ist die<br />
Änderung der freien Standardenthalpie eine charakteristische thermodynamische<br />
Konstante einer jeden Reaktion.<br />
Es ist wichtig, die unterschiedlichen Definitionen der Parameter ∆G (Änderung der freien Enthalpie)<br />
und ∆G o (Änderung der freien Standardenthalpie) genau zu beachten und zu verstehen. Hier soll der<br />
Unterschied anhand einer Analogie plausibel gemacht werden:<br />
so wie der pK-Wert einer schwachen Säure bei gegebener Temperatur eine Konstante ist, ist ∆G o die<br />
Konstante einer jeden Reaktion. Auf der anderen Seite ist ∆G mit der Konzentration der<br />
Reaktionspartner veränderlich, etwa so, wie sich der pH-Wert in der Lösung einer schwachen Säure<br />
mit den Konzentrationen der Protonendonoren und -akzeptoren ändert.<br />
Gleichheit zwischen ∆G und ∆G o herrscht nur bei (hypothetischen) Konzentrationen von 1 M und zwar<br />
9 Schon an dieser Stelle zeichnet sich allerdings ab, dass ∆G o = ∆G wird, wenn alle Edukte und<br />
Produkte in Konzentrationen von 1 mol/l vorliegen und somit ln([C] c. [D] d /[A] a. [B] b ) gleich Null wird.<br />
Aufgrund des Vorzeichens kann aus ∆G o also die (hypothetische) Reaktionsrichtung bei 1 M<br />
Konzentrationen aller Reaktionspartner abgelesen werden.
38<br />
Standardenthalpie<br />
für alle Edukte und Produkte. Dies entspricht der Bedingung pH = pK wenn Protonendonor und -<br />
akzeptor gleichkonzentriert sind.<br />
Damit wird klar, dass ∆G derjenige Parameter ist, welcher die Reaktionsrichtung<br />
bestimmt (bei negativem ∆G liegt die Reaktionsrichtung auf der Produktseite, d.h. die<br />
freie Enthalpie kann beim Reaktionsverlauf einem Minimum zustreben). Andererseits<br />
kann eine durch positives ∆G o gekennzeichnete Reaktion durchaus in der<br />
geschriebenen Richtung ablaufen, sofern die Ausgangskonzentrationen ein negatives<br />
∆G gewährleisten.<br />
Die obigen Zusammenhänge ermöglichen eine gegenseitige Umrechnung von<br />
Gleichgewichtskonstanten und ∆G o -Werten und gleiches leistet auch das Programm<br />
"G0" im Praktikums-Programmpaket. Bitte, überzeugen Sie sich von der qualitativen<br />
Richtigkeit der folgenden Zusammenhänge (∆G o -Angaben nach neuer SI-<br />
Konvention, d.h. in kJ/mol)<br />
Tabelle 5.1: Gleichgewichtskonstante und ∆G o : nur die Daten für exergonische<br />
Reaktionen (negatives ∆G o ; unter Standardbedingungen spontan ablaufend) sind<br />
gezeigt.<br />
K<br />
∆G o<br />
1 0<br />
10 - 6<br />
10 2 -11<br />
10 3 -17<br />
10 4 -23<br />
10 5 -29<br />
Bei Umkehrung der Vorzeichen, d.h. für endergonische<br />
Reaktionen, gelten für K die Kehrwerte. Bitte bedenken Sie,<br />
dass exergone Reaktionen diese Eigenschaft haben können,<br />
weil sie exotherm verlaufen (∆H negativ) oder weil sie<br />
Entropie-getrieben sind (∆S positiv). Diese Zusammenhänge<br />
folgen aus dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik in der<br />
Form<br />
∆G = ∆H - T∆S<br />
5.2 Freie Standardenthalpien von Glycolysereaktionen in kcal/mol für pH 7<br />
Vergl. Schema in Kap. 2.1; Angaben dort nach herkömmlicher Konvention, d.h. in<br />
kcal/mol.<br />
5.3 Freie Standardenthalpie der GAPDH- und GDH-Reaktionen<br />
5.3.0 Aufgabe B0: Umrechnung von Gleichgewichtskonstanten, ∆G o - und ∆G-<br />
Werten<br />
- Berechnen Sie aus den ∆G o Werten im Glycolyseschema (S. 18) die<br />
Gleichgewichtskonstanten für sämtliche Reaktionen der Glycolyse und<br />
der alkoholischen Gärung (Reaktionen 1-12). Für Ihre Bemühungen steht<br />
das Computerprogramm "G0" zur Verfügung.<br />
- Die freie Standardenthalpie, ∆G o , der Aldolasereaktion beträgt +5.7<br />
kcal/mol und ähnelt damit jenem für die LDH-Rückwärtsreaktion<br />
- Wie groß wird die freie Enthalpie ∆G bei 1E-3M (d.h. 1mM) Konzentrationen<br />
aller Reaktionspartner (F-1.6BP, GAP, DAP)? Setzen Sie für
39<br />
Standardenthalpie<br />
R . T den Wert 1.99E-3 . 298 [kcal/mol] bzw. 8.31E-3 . 298 kJ/mol<br />
- kann die Reaktion unter physiologischen Bedingungen ablaufen, d.h. wie<br />
groß sind die Gleichgewichtskonzentrationen von DAP und GAP, wenn<br />
Sie F-1.6DP als 1E-3 ansetzen?<br />
5.3.1 Versuch B1: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GAPDH-<br />
Reaktion:<br />
Reaktion (Gleichgewichtseinstellung)<br />
Definitionen 10 :<br />
∆G o = - RT ln K<br />
= - 2.478 lnK (kJ/mol)<br />
= - 0.592 lnK (kcal/mol)<br />
K = [1,3-BPG] . [NADH,H + ]<br />
[P i ] . [GAP] . [NAD + ]<br />
Materialien: Siehe Versuch A7.3 (Puffer von pH 8.5 und zusätzlich von pH 7.0, s.u.);<br />
GAPDH ist aus der Kristallsuspension (Fa. Boehringer) anzusetzen.<br />
Durchführung: Zunächst sind die Konzentrationen der Stammlösungen für NAD + und<br />
GAP zu bestimmen:<br />
-für NAD + unter Zugrundelegen des molaren Extinktionskoeffizenten, ε 259 = 17800<br />
-für GAP durch enzymatische Standardisierung (Versuch A7.2). Sollwerte der<br />
Stammlösungen jeweils: 7.5x10 -3 M<br />
10 Es ist nicht ganz leicht zu verstehen, warum auch im vorliegenden Fall (Zahl der Edukte ungleich<br />
der Zahl der Produkte) die Gleichgewichtskonstante K als dimensionslose Größe gesehen wird und nur<br />
wenige Lehrbücher nehmen sich dieser Problematik an (z.B. N.C Price & R.A. Dwek (1984) in<br />
"Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists", S. 21f; I. Mills et. al. (1988)<br />
Quantities, Units and Symbols in Physical Chemistry, Blackwell; R. A. Alberty & A. Cornish-Bowden<br />
(1993) TIBS 18, 288-291). So lautet die vollständige Definition der Gleichgewichtskonstanten im<br />
vorliegenden Falle<br />
K = [1,3-BPG]/[1,3-BPG] o . [NADH,H + ]/[NADH,H + ] o<br />
[P i ]/[Pi] o . [GAP]/[GAP] o . [NAD + ]/[NAD] o<br />
das heißt, für jeden Reaktionspartner wäre korrekt der Quotient aus seiner<br />
Gleichgewichtskonzentration und seinem Standardzustand anzusetzen. Standardzustände werden<br />
normalerweise als Lösungen mit 1 mol/l unter dem Druck von 1 Atmosphäre definiert. Wenn sie somit<br />
stillschweigend = 1 gesetzt werden, so erfordert dies doch die Angabe aller Konzentrationen in [mol/l].
40<br />
Standardenthalpie<br />
Man vereinigt alle Komponenten, wie unter A7.3 beschrieben (so dass [NAD + ]<br />
und [GAP] jeweils Endkonzentrationen von 25 × 10 -5 M haben) und verfolgt den<br />
Reaktionsablauf bis zu Ende. Aus der schließlich erreichten Extinktion bei 340 nm<br />
ergibt sich die Gleichgewichtskonzentration von NADH,H + (ca. 1×10 -5 M, abhängig vom<br />
pH Wert). Die Gleichgewichtskonzentration für NAD +<br />
ergibt sich dann durch<br />
Subtrahieren dieses Wertes von der Anfangskonzentration an NAD + (d.h. 25 × 10 -5 M).<br />
Die Konzentration an 1,3-BPG entspricht dann zwangsläufig jener an NADH,H + und<br />
[GAP] gleicht der Gleichgewichtskonzentration von NAD + . Infolge seiner hohen<br />
Konzentration bleibt P i praktisch unverändert und kann zu 5000 × 10 -5 M<br />
(entsprechend 50 mM) eingesetzt werden.<br />
- Welchen Wert hat die Gleichgewichtskonstante der Reaktion?<br />
- Welche "freie Standardenthalpie" folgt daraus?<br />
- Warum kann dieser Wert sich nicht mit dem Literaturwert decken?<br />
- Führen Sie den gleichen Versuch bei pH 7 durch und überprüfen Sie<br />
nochmals die Übereinstimmung mit dem Literaturwert. Um messbare<br />
Veränderungen zu erzielen kann es dabei notwendig sein, die Substratkonzentration<br />
anzuheben. Folgerungen?<br />
5.3.2 Versuch B2: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GAPDH-Reaktion (kinetischer Ansatz) zur Zeit nicht<br />
durchgeführt<br />
Unter einigen noch zu diskutierenden, vereinfachenden Annahmen ergibt sich die Gleichgewichtskonstante aus dem Verhältnis<br />
der Geschwindigkeitskonstanten (Aktivitäten) von Hin- und Rückreaktion:<br />
K entspr. k 2 /k- 2 (in der Definition von Kap. 8.2)<br />
Zwischen der Gleichgewichtskonstanten und der freien Standardenthalpie besteht, wie erwähnt, der folgende Zusammenhang:<br />
∆G o<br />
= -RTlnK<br />
= -2.478 ln k [kJ/mol]<br />
= -0.592 ln K [kcal/mol] für T = 298 (25 o C)<br />
Eine Gleichgewichtskonstante von 0.3 würde somit eine freie Standardenthalpie von<br />
∆G o = -0.592 . ln 0.3 = -0.592 . (-1,20)<br />
= +0.71 kcal/mol)<br />
bedeuten: Das Gleichgewicht wäre bei 1 M Konzentration aller Reaktionspartner (GAP, 1,3-BPG, NAD + , NADH,H + und P i ) nach<br />
links verschoben, die Reaktion wäre endergonisch (Gegensatz: exergonisch).<br />
Materialien:<br />
Puffer 1: 80 mM TEAxHCl (pH 7.0)<br />
8 mM MgCl 2<br />
12 mM 3-PG<br />
Puffer 2: 80 mM TEAxHCl (pH 7.0)<br />
8 mM MgCl 2<br />
50 mM NaH 2 PO 4
41<br />
Standardenthalpie<br />
GAPDH:etwa 20 µg/ml, angesetzt aus einer Kristallsuspension in Puffer 1. ggf. PGK als Hilfsenzym (5 µl<br />
Kristallsuspension)<br />
Man bestimme die enzymatische Aktivität (d.h., die Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung!) sowohl im Vorwärtstest<br />
(analog Versuch A7.3, jedoch bei pH 7, d.h. mit Puffer 2) als auch im Rückwärtstest (analog Versuch A2, jedoch mit Puffer 1 und<br />
PGK als Hilfsenzym); in beiden Fällen sind 100 µl derselben (in ihrer Konzentration optimierten) GAPDH-Lösung einzusetzen.<br />
Beachte, dass bei Anordnung B1 die Enzymkonzentration keine, die Substratkonzentration jedoch die entscheidende Rolle spielt,<br />
während es hier (Sättigungsbedingungen vorausgesetzt) exakt umgekehrt ist.<br />
Ziel:<br />
Das Enzym sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtsreaktion mit maximaler Umsatzgeschwindigkeit<br />
arbeiten zu lassen, gleichzeitig nach den in Kapitel 8.12 genannten Kriterien eindeutig auswertbare Kinetiken zu erhalten<br />
(Stichworte: Anfangssteigung, Tangente an den Ursprung, Computersimulation). Nach Möglichkeit sollte versucht werden, den<br />
Messbereich des Photometers zehnfach zu spreizen (Vollausschlag dann: 0.1 Extinktionseinheiten). Weiterhin können folgende<br />
Parameter variiert werden:<br />
- Substratkonzentrationen oberhalb eines bestimmten Wertes (hohe Konzentrationen geben häufig besser<br />
auswertbare Kinetiken)<br />
- Anwendung des "Hydrazin-Tricks" (Kap. 4.3.2) zum Abfangen des Produktes der Rückwärtsreaktion, d.i. GAP;<br />
man untersuche den Einfluss von 50 mM Hydrazin in Puffer (1) (pH-Kontrolle!).<br />
Aus dem gewonnenen Verhältnis maximaler Reaktionsgeschwindigkeiten bestimme man schließlich die Gleichgewichtskonstante<br />
und hieraus den Wert ∆G o , dieser sollte mit dem Resultat des Versuches B1 übereinstimmen. Eventuelle Abweichungen wären<br />
zu erklären (Stichworte: suboptimaler pH-Wert für Enzym oder Hilfsenzym; Sättigung nicht zu erreichen, K d -Werte für ES und EP<br />
Komplex verschieden etc.).<br />
Literaturdaten (A. Lehninger, "Biochemistry")<br />
D-Glyceraldehyde-3-phosphate + NAD + + P i _ > 1.3-Diphosphoglycerate + NADH,H + ;<br />
∆G o = + 1.5 kcal/mol<br />
The overall reaction has a slightly positive value of ∆G o (+1.5 kcal . mole -1 ) and thus proceeds readily in<br />
either direction depending on the concentration of the reactants.<br />
5.3.3 Versuch B3: Gleichgewichtskonstante und ∆G o -Wert der GDH-Reaktion<br />
Glycerinphosphat-DeHydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion:<br />
Das Gleichgewicht der vorgeschalteten TIM-Reaktion liegt auf der Seite des DAP.<br />
Folgende Materialien stehen zur Verfügung:<br />
Enzyme:<br />
Substrate:<br />
GDH und TIM<br />
GAP und G-3P
42<br />
Standardenthalpie<br />
Aufgaben: Diskutieren Sie die prinzipiellen Möglichkeiten zur Bestimmung von K und<br />
∆G o der GDH-Reaktion. Wählen Sie (aufgrund Ihrer Erfahrungen aus B1 und B2) eine<br />
dieser Möglichkeiten und führen Sie diese praktisch aus. Geben Sie die freie Enthalpie<br />
für die Reaktion von DAP zu G-3P an (Vorzeichen!).<br />
Anmerkung: Dieser Versuch fördert Ihre Kreativität. Daher gibt es keinen Pipettierplan; dieser ist im<br />
"trial-and-error"- Verfahren zu optimieren. Ein geeigneter Puffer mit pH 7,0 ist aus dem vorliegenden<br />
Manuskript abzuleiten und anzusetzen.
43<br />
Metaboliten<br />
6. BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN<br />
BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN<br />
• NACH DER ENDPUNKTMETHODE:<br />
6.1 Das Messprinzip<br />
Bei der Konzentrationsbestimmung von Substraten und Coenzymen misst man im<br />
allgemeinen nach der Endwert-Methode den gesamten Umsatz. Verläuft - was<br />
experimentell immer angestrebt wird - die Reaktion gemäß günstiger Gleichgewichtslage<br />
quantitativ, so ist das Anlegen von Bezugskurven überflüssig. Um die<br />
Reaktion möglichst zu beschleunigen, arbeitet man mit relativ hohen Enzymkonzentrationen.<br />
Gelegentlich kommt die Reaktion nicht vollständig zum Stillstand. Man<br />
beobachtet vielmehr eine langsame, kontinuierliche Extinktionsveränderung<br />
("Schleich-Reaktion"). Diese Extinktionsveränderung überlagert sich der gesamten<br />
Reaktion, so dass graphisch auf die Zeit des Starts (t o ) zu extrapolieren ist. Zur<br />
Extrapolation wartet man, bis die Reaktionsrate über 4 - 5 Min konstant bleibt, dann<br />
verlängert man den linearen Teil der Kurve bis zur Zeit t o . Aus den Schnittpunkten mit<br />
der Ordinate erhält man dann die wahre Extinktionsänderung, die man der<br />
Berechnung zugrunde legt:<br />
Abb. 6.1: Berücksichtigung einer "Schleichreaktion"<br />
6.2 C1: Versuche am Kaninchenmuskel-Extrakt
44<br />
Km/Ki<br />
Versuche C1 bitte am frischen Muskelextrakt (Präparat der Gruppe 1) durchführen.<br />
Einwaage an Muskelgewebe sowie Endvolumen erfragen!<br />
6.2.1 Versuch C1.1:Nachweis von ATP<br />
Während der Glycolyse werden zwei Moleküle ATP je Molekül Glucose mehr gebildet als<br />
verbraucht (Kapitel 2.1). Der Nachweis von ATP gelingt auf der Basis des Versuchs A2 mit<br />
den dort angegebenen Lösungen:<br />
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.8 ml der Testmischung (1) und justiert das Photometer damit<br />
auf E 340 = 0. Sodann setzt man 100 µl der NADH,H + -Lösung (2) zu. Zugabe von 100 µl<br />
konzentrierter glycolytischer Lösung ergibt im Falle der Anwesenheit von ATP ein Absinken<br />
der optischen Dichte bei 340 nm. Nach Erreichen eines minimalen E 340 -Wertes stellt man<br />
durch erneute Zugabe von 100 µl der NADH,H + -Lösung sicher, dass dieses nicht zum<br />
limitierenden Faktor geworden ist. Wie hoch ist die ATP Konzentration in glycolyt. Lösung?<br />
6.2.2 Versuch C1.2:Nachweis von 3-PG<br />
Dieser Versuch unterscheidet nicht zwischen freiem 3-PG und solchem in Bindung an<br />
GAPDH (vgl. Formel für das Acylenzym in Kapitel 3.4 und J. Biol. Chem. 246, 780 (1971)). Neben<br />
den Substanzen unter A2 wird benötigt:<br />
1') Testmischung:<br />
80 mM TEA<br />
1 mM EDTA<br />
9 mM MgSO 4 , pH 7.6 (mit HCl).<br />
Man füllt eine QS-Küvette mit 2.7 ml der Testmischung 1' sowie 100 µl der ATP-Lösung<br />
3). Nach Justieren des Photometers auf E = 0 werden 100 µl NADH,H + -Lösung (2)<br />
zugesetzt. Zufuhr von 100 µl konzentrierter glycolytischer Lösung führt zum Absinken der<br />
Extinktion bei 340 nm, falls diese 3-PG enthält. Wie hoch ist dessen Konzentration in<br />
glycolyt. Lösung? Wird das Ergebnis durch Folgemetabolite des 3-PG (2-PG, Pyruvat,<br />
Lactat) beeinflusst? Überprüfen Sie dies, indem Sie 100 µl 5 mM Lösungen dieser<br />
Metabolite zum obigen Gemisch pipettieren und Änderungen der Extinktion verzeichnen.<br />
6.2.3 Versuch C1.3: Nachweis von DAP und benachbarten Metaboliten<br />
Für den Nachweis werden Substanzen aus A3/A5 benötigt. Man fülle eine QS-Küvette mit<br />
2.7 ml der Testmischung (1) und 5 µl Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (Kristallsuspension).<br />
Mit dieser Mischung eiche man das Photometer auf E 340 = 0. Durch<br />
Zugabe von 100 µl NADH,H + (3) erreicht man E 340 = 1. Führt die Zugabe von 100 µl<br />
glycolytischer Lösung zu einer Abnahme der Extinktion bei 340 nm? Kann diese durch<br />
Versetzen mit 100 µl einer 75 mM ATP-Lösung noch gesteigert werden?
45<br />
Km/Ki<br />
Zur Ergänzung und falls die Zeit reicht:<br />
- Ist dieser Versuch in der Lage, zwischen DAP, F-1,6-BP und den weiteren Vorläufern (Fructose-6-P,<br />
Glucose-6-P) zu unterscheiden? D.h. erzielen Sie eine weitere Erniedrigung der E 340 -Ablesung, falls<br />
Sie ca. 20 µl Portionen der genannten F-1,6-BP Vorläufer zufügen (Stammlösungen: 25 mM)?<br />
- Ändern sich die Ergebnisse, falls Sie die EDTA-Konzentration der Testmischung von 0.36 mM EDTA<br />
auf 5 mM EDTA heraufsetzen und falls dies zutrifft: warum?<br />
Bitte die Aussagekraft der Versuche kritisch durchdenken! Bei allen Interpretationen<br />
stets davon ausgehen, dass noch alle Glycolyse-Enzyme zugegen sind und aktiv sein<br />
könnten.<br />
6.2.4 Versuch C1.4: Lage des NAD + /NADH,H + -Gleichgewichtes im Muskel<br />
Im Muskel wird das Gleichgewicht der Coenzyme durch zwei Enzyme, GAPDH und LDH<br />
gesteuert:<br />
Abb. 6.2 Gegenseitige Abhängigkeit der<br />
GAPDH-und LDH-Reaktionen bei anaerober<br />
Glycolyseführung.<br />
Mit Ausnahme geringer Mengen NADH,H + , die<br />
durch Glycerinphosphatdehydrogenase<br />
(GDH)verbraucht werden, muss der Großteil an<br />
NAD + durch die LDH-Reaktion regeneriert<br />
werden.<br />
Das Vorliegen von Triosephosphat-Vorstufen (Versuch C3) sowie von ATP (Versuch C1) im<br />
Muskelextrakt schließt eine direkte Untersuchung des NAD + - bzw. NADH,H + -Gehaltes auf<br />
Grund der obigen Kopplung der GAPDH- und LDH-Reaktionen aus: durch LDH oxidiertes<br />
NAD + steht unmittelbar als GAPDH-Cosubstrat zur erneuten Reduktion zur Verfügung. Eine<br />
weitere Komplikation besteht darin, dass NAD + sich innerhalb von Stunden im Muskelgewebe<br />
zu einer Substanz "NADR" umsetzt, d.h. nur unmittelbar nach dem Schlachtvorgang<br />
nachweisbar ist. Diesen Schwierigkeiten wird wie folgt Rechnung getragen:<br />
- Ein Gemisch aus gleichen Anteilen NADH,H + und NAD + wird im Muskelextrakt bis zur<br />
Gleichgewichtseinstellung belassen,<br />
- das erzielte Gleichgewicht wird durch Zerstörung der beteiligten Enzyme fixiert. Für<br />
die jeweilige Analyse wird dann nur die benötigte Aktivität zugesetzt.<br />
Substanzen:<br />
1) LDH-Puffer aus A1.1 (0.03 M Na-phosphat, pH 7.4)<br />
2) Aldolase/GAPDH-Puffer aus A3
46<br />
Km/Ki<br />
3) 50 mM Na-pyruvat in (1)<br />
4) 10 mM NADH,H + + 10 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!)<br />
5) 0.48 M Na 2 HAsO 4 in (1)<br />
6) 25 mM F-1,6-BP in (1)<br />
7) Pepsin, LDH, GAPDH, TIM, Aldolase als Kristallsuspensionen.<br />
500 µl konzentrierter Muskelextrakt werden mit 500 µl NAD + /NADH,H + -Gemisch (4) versetzt<br />
und zur Einstellung des NAD + /NADH,H + Gleichgewichtes für 30 min temperiert (37 o ). Mit<br />
verdünnter HCl wird sodann pH 2 eingestellt. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den<br />
Extrakt für 30 min bei 37 o proteolytisch ab. Nach diesem Schritt stellt man pH 7.4 mit<br />
verdünnter Ammoniaklösung ein, zentrifugiert und verwendet den Überstand zu folgenden<br />
Analysen:<br />
NADH,H + : 2.7 ml des Puffers (1) werden mit 5 µl LDH versetzt, damit wird das Photometer<br />
auf E 340 =0 geeicht. Nach Zusatz von 100 µl des obigen Überstandes kann die Oxidation von<br />
eventuell vorhandenem NADH,H + durch Zugabe von 100 µl Pyruvat (3) gestartet werden.<br />
Man registriere den Abfall der E 340 .<br />
NAD + : 1,7 ml der Mischung (2) werden mit 1 ml F-1,6-BP (6) und 100 µl Arsenat (5) versetzt.<br />
Nach Zugabe von 100 µl des obigen Überstandes wird das Photometer auf E 340 = 0<br />
gebracht. Bei Gegenwart von NAD + sollte die Zugabe der Hilfsenzyme GAPDH, TIM und<br />
Aldolase zum Ansteigen der E 340 führen. Beim Ausbleiben einer Reaktion ist durch<br />
Coenzym-Zugabe die Richtigkeit des Ansatzes zu überprüfen.<br />
Bestimmen Sie den Quotienten ((NAD + )+(NADH,H + ))/((NAD + ) input + (NADH,H + ) input ), d.h.<br />
den Anteil an Coenzym, den Sie nach der Inkubation zurückgewinnen können. Was<br />
sagt Ihr Ergebnis aus über den Verbleib/die Stabilität dieser Coenzyme?<br />
6.3 C2:Versuche an diversen proteinfreien Extrakten<br />
6.3.1 C2.1 Herstellung eines Extraktes aus Kaninchenherz (zur Zeit nicht durchgeführt)<br />
5 g Kaninchen-Herzmuskel (etwa ein halbes Herz) werden in einem Porzellanmörser mit flüssiger Luft tiefgefroren. Nach Auflegen eines<br />
Tuches läßt sich das Gewebe zerstampfen. Man setzt einige Löffel Trockeneis sowie 50 ml 8%ige Perchlorsäure zu und verreibt die Masse<br />
bis fast zur Homogenität (Perchlorsäure-Endkonzentration: etwa 0.6 M). Nach langsamem Auftauen steht das Gemisch für weitere 15 min<br />
bei 0 o (gelegentlich aufrühren!). Man zentrifugiert bei 0 o für 5 min bei 10.000 Upm im SS34-Rotor. Der Überstand wird vorsichtig (!!) mit<br />
einer Lösung aus 1 M TEA (freie Base)/6 M KOH neutralisiert, gegebenenfalls zur Klärung nochmals zentrifugiert.<br />
6.3.2 C2.2:Deproteinierung des Skelettmuskelextraktes durch Pepsin (z.B. zu Versuch C1.4)<br />
Analog Versuch C1.4 werden 500µl konzentrierter Kaninchen-Skelettmuskelextrakt (von Gruppe 1) im Eisbad mit 0.1 M HCl auf<br />
pH 2 gebracht. Man setzt 50 µg Pepsin zu und baut den Extrakt für 30 min bei ca 4 o proteolytisch ab. Danach stellt man mit verdünnter<br />
Ammoniaklösung pH 7.4 ein. Nach Zentrifugieren weist man die Zerstörung enzymatischer Aktivitäten anhand eines robusten Enzyms nach<br />
(z.B. über einen LDH-Test analog Versuch A1.2).
47<br />
Km/Ki<br />
6.3.3 C2.3:Metabolitengemisch unbekannter Herkunft und Zusammensetzung<br />
Wir geben Ihnen eine proteinfreie Metabolitenlösung, deren Herkunft und damit Zusammensetzung nur uns<br />
bekannt ist.<br />
6.3.4 Versuch C2.4.1:Energiereiche Phosphate: ATP<br />
Abb. 6.3: Analyseschema "energiereiche Phosphate": ATP und Creatinphosphat.<br />
CP, Creatin-phosphat; CPK, Creatin-phosphokinase<br />
Prinzip:<br />
Puffer:<br />
0.1 M TEA (freie Base), pH 7.6 (mit HCl)<br />
10 mM MgCl 2<br />
2 mM EDTA<br />
2.5 mM Hydrazin (kein Hydrazinsulfat!)<br />
Hilfsenzyme:<br />
PGK und GAPDH<br />
als gemischte Kristallsuspension oder Extrakt<br />
Creatinphosphokinase (CPK)<br />
30 mg in 1 ml H 2 O gelöst<br />
2.7 ml Puffer werden mit 5 µl Hilfsenzymen sowie 100 µl (optimieren!!) des zu<br />
analysierenden Extraktes versetzt. Nach Eichen des Photometers auf E 340 = 0 setzt man 100<br />
µl 4.8 mM NADH,H + (aus A1) zu. Dann startet man die Reaktion durch 100 µl 360 mM 3-PG.<br />
Falls NADH,H + die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der<br />
ATP-Konzentration.
48<br />
Km/Ki<br />
Versuch C2.4.2:<br />
Energiereiche Phosphate: Creatin-Phosphat (CP)<br />
Prinzip:<br />
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.1 bestimmt man im gleichen Testansatz Creatinphosphat<br />
(CP). Die Reaktion sollte sich direkt, nach Zusatz von 10 µl Creatin-Phosphokinase starten<br />
lassen. Falls NADH,H + die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein<br />
Maß der CP-Konzentration.<br />
6.3.5 Versuch C2.4.3:Energiemangel-Metabolite: ADP<br />
Abb. 6.4: Analyseschema "Energiemangel-Metabolite": ADP, AMP und Creatin.<br />
CR, Creatin; MK, Myokinase, PK, Pyruvat-kinase, CPK, Creatin-phosphokinase<br />
Prinzip:<br />
Puffer: 0.1 M TEA, pH 7.6<br />
3 mM MgCl 2<br />
7 mM KCl<br />
PEP:<br />
50 mM<br />
Hilfsenzyme: Pyruvatkinase (PK), LDH, Myokinase (MK): Kristallsuspensionen<br />
CPK (Lösung aus C.4.2)
49<br />
Km/Ki<br />
Zu 2.7 ml Puffer gibt man 100 µl des zu analysierenden Extraktes (optimieren!), je 5 µl LDH<br />
und PK und justiert das Photometer auf E 340 = 0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H +<br />
(aus A1) startet man die Reaktion mit 100 µl PEP-Lösung. Falls NADH,H + die Reaktion nicht<br />
limitiert (überprüfen!), ist der Abfall der E 340 ein Maß der ADP-Konzentration.<br />
Versuch C2.4.4:- AMP<br />
Prinzip:<br />
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.3 bestimmt man im gleichen Testansatz die AMP-<br />
Konzentration. Die Reaktion sollte sich durch 5 µl Myokinase (MK-Kristallsuspension) starten<br />
lassen. Bitte bei der Rechnung berücksichtigen: aus 1 AMP werden 2 ADP. Falls NADH,H +<br />
die Reaktion nicht limitiert (überprüfen!), ist der erneute Abfall der E 340 ein Maß der AMP-<br />
Konzentration.<br />
Versuch C2.4.5:- Creatin<br />
Prinzip:<br />
Nach Ablauf der Reaktion C2.4.4 wird der gleiche Ansatz zur Bestimmung von Creatin<br />
vorbereitet. Man stellt mit einer gesättigten K 2 CO 3 -Lösung vorsichtig (!) pH 9.2 ein, versetzt<br />
nochmals mit 100 µl PEP sowie mit 100 µl 75 mM ATP (ADP-frei, aus A2) und justiert das<br />
Photometer mit dieser Mischung auf E 340 =0. Nach Zugabe von 100 µl 4.8 mM NADH,H + läßt<br />
sich die Reaktion durch 100 µl (3 mg) Creatinphosphokinase (CPK) starten 11 . Falls NADH,H +<br />
die Reaktion nicht limitiert, ist der Abfall der E 340 ein Maß der Creatin-Konzentration. Zu<br />
dessen Berechnung bitte Verdünnung (durch pH-Einstellung etc.) berücksichtigen.<br />
11 Das Gleichgewicht der CPK-Reaktion hängt stark vom pH-Wert ab; im schwach Sauren liegt es auf der<br />
Seite des Creatin, im Alkalischen auf der des Creatin-phosphats. Da die Wechselzahl des Enzyms gering ist<br />
(25000 mol/(mol . min) bei 38 o ) sind größere Mengen zum schnellen Reaktionsablauf nötig.
50<br />
Km/Ki<br />
BESTIMMUNG VON METABOLITENKONZENTRATIONEN IN BIOLOGISCHEN<br />
FLÜSSIGKEITEN<br />
• NACH DER KINETISCHEN METHODE<br />
6.4.1 Das Messprinzip<br />
Die Sättigungsfunktion der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit (Kapitel<br />
8.1) gehorcht der Michaelis-Menten Beziehung (Kapitel 8.2).<br />
v<br />
= V max × S<br />
K m + S<br />
Für den Fall, dass die zu bestimmende Substratkonzentration gegenüber K m<br />
vernachlässigbar ist (S
51<br />
Km/Ki<br />
Spezies Luciferase Luciferin Emissions-Wellenl./ Art<br />
__________________________________________________________<br />
Bakterien M r 80k FMNH 2 +RCHO 495nm/kontinuierl.<br />
Dinoflagell. M r 420k Polypyrrol 465nm/Blitz<br />
Coelentrate M r 21k Colenterazine 460nm/ "<br />
Photinus M r 100k Benzthiazole 560nm/ "<br />
Die Luciferine verschiedener Spezies variieren grundlegend. Entsprechend gibt es verschiedene Luciferasen,<br />
die als Peroxidasen, Mono- oder Dioxigenasen arbeiten können. Die verschiedenen mechanistischen<br />
Gegebenheiten ermöglichten eine Fülle neuer analytischer Verfahren zum Nachweis von Energieträgern (ATP,<br />
NADH,H + , FMNH 2 ), Kationen (Mg ++ , Ca ++ , Sr ++ ) und (aufgrund ihres ATP-Gehaltes) zu Bakterienzähllungen:<br />
Spezies<br />
Reaktionsbedingungen<br />
_______________________________________________________<br />
Bakterien NADH,H + und FMNH 2<br />
Photinus (Leuchtkäfer)<br />
und Renilla (Federkoralle) ATP, Mg ++<br />
Aequora (Qualle) Photoprotein, Ca ++ , Sr ++<br />
Cypridina (Muschelkrebs) -<br />
In diesem Praktikum soll der Nachweis von ATP und ATP-Vorstufen durch Biolumineszenz<br />
demonstriert werden. Vor Aufkommen der Luminometer konnten hierfür mit einigem Erfolg<br />
die für Radiolumineszenzmessungen entwickelten Szintillationszähler eingesetzt werden, da<br />
beide Methoden auf der Zählung von Lichtblitzen je Zeitintervall beruhen. Es wird gezeigt,<br />
dass für diesen Test rohe Leuchtkäfer-Extrakte eingesetzt werden können, da diese sowohl<br />
Luciferase als auch Luciferin (leider auch einiges an ATP) mitbringen.<br />
6.5 Biolumineszenzmessungen mit einem Luminometer 12<br />
6.5.1 Versuch C3.0:Luciferin/Luciferasepräparat<br />
Puffer:<br />
25 mM Glycylglycin (pH 7.8 mit 0.1 M KOH)<br />
15 mM MgSO 4<br />
Luciferin/Luciferasereagens:<br />
50 mg getrocknete Leuchtorgane (Sigma FFT, Firefly Lantern, desiccated tails, 500 mg DM 46,92 oder Sigma<br />
FFW, desiccated whole Fireflies, 5 g DM 85,--) werden mit Hilfe eines 15 ml Potter-Homogenisators und 5 ml<br />
eiskaltem 0.1 M Arsenat für mindestens 5 min sorgfältig homogenisiert und in Intervallen gevortext. Das<br />
Homogenat wird dann zur teilweisen Klärung zentrifugiert (8000 xg, 3 min). Die Überstände füllt man mit 0.1 M<br />
Arsenat auf 50 ml auf und setzt 500 mg MgSO 4 x 7 H 2 O zu. Bei 4 o hält sich diese Lösung für mehrere Tage.<br />
Achtung: Mit der Zugabe von MgSO 4 wird die Luciferin-Luciferasereaktion gestartet, d.h., endogenes ATP<br />
verbraucht. Die Lösung sollte nicht unmittelbar verwendet werden, da sonst sehr hohe Blindwerte resultieren<br />
können.<br />
6.5.2 Versuch C3.1:Eichreihe für ATP<br />
Daten für ATP: M r = 507.2; ε 259 = 15 400; Verdünnungslösung: 5 mM MgCl 2 in Wasser.<br />
12 Zu diesem Versuch gibt es eine Vorläufer-Vorschrift, die auf den Gebrauch (die 'Zweckentfemdung') eines<br />
Szintillationszählers zugeschnitten war. Derzeit sind wir auf solchen Behelf nicht angewiesen.
52<br />
Km/Ki<br />
1 mg ATP wird in 5 ml Verdünnungslösung aufgenommen und mit wenigen Tropfen<br />
0.1 M NaHCO 3 neutralisiert; die Konzentration wird durch Extinktionsmessung bei 259 nm<br />
bestimmt (E 259 für diese Lösung: ca. 5; zu überprüfen an einer 1:10 Verdünnung). Durch<br />
weiteres Verdünnen wird hieraus eine 0.4 µM ATP-Stammlösung hergestellt (endgültiger<br />
Verdünnungsfaktor etwa 1000).<br />
Eichreihe:<br />
ATP-Stammlösung (µl)<br />
Verdünnungslösung (µl)<br />
10 990(1)<br />
20 980(2)<br />
30 970(3)<br />
...<br />
...<br />
100 900(10)<br />
Diese Lösungen sind im Gerät vorzulegen. Luciferin/Luciferasereagenz wird auf Knopfdruck<br />
injiziert; die Zahle der Lichtblitze wird im Verlauf von 10 s automatisch summiert und<br />
angezeigt (Integralmessung).<br />
- Welches ist die Messgrenze des hier beschriebenen Verfahrens, d.h., welche<br />
Menge (in g) an ATP liefert noch eine Ablesung, welche um den Faktor 10 über<br />
dem Blindwert liegt?<br />
- Liefern die obigen Ablesungen eine Eichgerade? Erklären Sie eventuelle<br />
Abweichungen.<br />
6.5.3 Versuch C3.2: Energiereiche Phosphate: ATP und Creatin-Phosphat<br />
Zur Analyse steht nach Kapitel 6.3.3 (Versuchsnummer C2.3) ein Metabolitengemisch mit<br />
ATP und Creatinphosphat im millimolaren Bereich zur Verfügung. Beide energiereichen<br />
Phosphate sollen quantifiziert werden, wofür die folgenden prinzipiellen Möglichkeiten<br />
denkbar sind:<br />
a - Sequenzielle Messung von ATP und CP. Bestimmung von ATP wie unter 6.5.2. Nach Ablauf der Luciferasereaktion (überprüfen!)<br />
Creatinphosphat mit Hilfe der CPK-Reaktion (C2.4.2) zu ATP umsetzen. Quantifizierung des so generierten ATP durch erneutes Starten<br />
der Luciferase/Luciferinreaktion.<br />
b - Parallele Bestimmung von ATP und Creatinphosphat. Im Falle des CP-Ansatzes wird zunächst freies ATP mit Hilfe der stark<br />
exergonen Hexokinasereaktion abgebaut. Nach Inaktivierung der Hexokinase wird ATP über die CPK-Reaktion (C2.4.2) aus CP generiert<br />
und dann wie oben vermessen.<br />
Substanzen: 10x TEA-Puffer pH 7.6<br />
0.5 M Triethanolamin-hydrochlorid, eingestellt mit NaOH<br />
10x Magnesiumchlorid<br />
0.1 M MgCl 2<br />
10x Glucose<br />
0.5 M Glucose<br />
Hexokinase: Kristallsuspension<br />
3.5 ml des Gemisches mit je 500 µl 10x TEA, 10x Magnesiumchlorid und 10x Glucose versetzen. 3µl Hexokinasesuspension zusetzen und<br />
Ansatz für 30 min bei Raumtemperatur belassen. Abwesenheit des ATP überprüfen, dann Enzymaktivitäten durch Erhitzen (5 min im<br />
kochenden Wasserbad) zerstören. Ansatz sofort im Eisbad abkühlen, CP durch CPK-Reaktion (C2.4.2) in ATP überführen und darüber wie<br />
oben quantifizieren.
53<br />
Km/Ki<br />
c - Summenbestimmung CP und ATP. Neben der üblichen Ermittlung des ATP-Wertes<br />
wird ein Parallelansatz der CPK-Reaktion (C2.4.2) unterworfen. Nach adäquater<br />
Verdünnung dient dieser Ansatz der Bestimmung von Gesamt-ATP. Der CP-Wert folgt durch<br />
Subtraktion des Wertes für ursprünglich freies ATP.<br />
Bitte Vor-und Nachteile dieser Ansätze diskutieren und die eigene Wahl begründen.<br />
Alle Verdünnungen so wählen, dass die Ablesungen in den unter 6.5.2 ermittelten<br />
Messbereich fallen.
54<br />
Km/Ki<br />
7 REGULATORISCHE ENZYME<br />
7.1 Phosphofructokinase: ein Schlüsselenzym bei der Regulation des Metabolitenflusses<br />
im Glycolyseweg<br />
Die doppelte Rolle der Glycolyse besteht in der Bereitstellung von Bausteinen für andere<br />
Biosynthesewege ("Sammelphase") und der Gewinnung chemischer Energie in Form von<br />
ATP ("Gewinnphase"). Bei aerobem Stoffwechsel stellt auch NADH,H + eine Form<br />
chemischer Energie dar (bei anaerobem Verlauf wird NAD + durch die LDH-Reaktion<br />
regeneriert).<br />
Zur Erfüllung dieser Bedürfnisse muss der Glucoseumsatz an solchen Enzymen reguliert werden, die<br />
irreversibel arbeiten und spezifisch für die Glycolyse sind. Kandidaten hierfür sind die Reaktionen der<br />
Phosphofructokinase (PFK) und der Pyruvatkinase (PK); die Hexokinasereaktion scheidet aus, da ihr Produkt,<br />
G-6P ein multifunktioneller Metabolit ist (in wiefern?).<br />
Als wichtigste Kontrollstelle gilt heute die PFK. Das Leberenzym, ein 340 kDa Tetramer, wird<br />
durch höhere ATP-Konzentrationen inhibiert, d.h. der K m -Wert des Substrates F-6P wird<br />
erhöht. Offenbar wird gleichzeitig ein kooperatives Bindungsverhalten induziert 13<br />
Versuch D2):<br />
(vergl.<br />
Abb.7.1: Allosterische Regulation der PFK durch ATP.<br />
Wie ATP sollen auch Citrat und PEP hemmend wirken,<br />
während AMP den inhibitorischen Effekt dieser<br />
Metaboliten unterbindet. Zusammengefasst reduzieren<br />
"Energieüberschusssignale" die Aktivität während<br />
Energiemangelsignale diesem Effekt entgegenwirken.<br />
Diese Eigenschaften der PFK bilden den wichtigsten Aspekt molekularer Erklärungen des<br />
Pasteur-Effektes, d.h. einer historischen Beobachtung wonach bei Umschaltung auf aeroben<br />
Stoffwechsel der Metabolitenstrom in der Glycolyse gedrosselt wird um eine gleichbleibende<br />
"energy charge" der Zelle zu gewährleisten.<br />
Ein "neues" Regulatormolekül der Glycolyse wurde 1980 durch H.-G. Hers und E. van<br />
Schaftingen entdeckt: F-2.6BP (Eur. J. Biochem. 159, 359), welches nach Art eines "dritten<br />
Messengers" zur Fortpflanzung von "Hungersignalen" entlang der Signaltransduktionskette<br />
Glucagon -> cAMP in der Leber dient (Kap. 7.2).<br />
13 Kooperativität gegenüber F-6P scheint unter den Bedingungen aufzutreten, die eine Dissoziation des<br />
Enzyms in seine Untereinheiten fördern, das sind eine hohe [ATP] und ein leicht acider pH-Wert (pH 6.9, cf. J.<br />
Biol. Chem. 243, 2523-2533, 1968). Da F-6P die Aktivierung/Assoziation der Protomeren zur aktiven Form<br />
fördert, ergibt sich ein kooperatives Ansprechen des Enzyms auf dieses Substrat.
55<br />
Km/Ki<br />
7.2 Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus von Effektoren bei oligomeren<br />
Enzymen: Beispiel der Phosphofructokinase der Glycolyse<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Phosphofructokinase<br />
Abb. 7.2:<br />
PFK - Wichtige Regulationsprinzipien; nur in vitro (Enzymkinetik) fällt F-1.6BP in Konzentrationen an, die eine<br />
Selbstaktivierung (Bindung statt 2.6.BPG) zur Folge haben können<br />
PFK besitzt ihr katalytisches Zentrum am N-Terminus, das regulatorische Zentrum am C-<br />
Terminus eines durch Genduplikation entstandenen Fusionsproteins. Beide Hälften zeigen<br />
infolgedessen Sequenzhomologien, unterlagen aber, entsprechend ihrer Aufgabe,<br />
getrennten Optimierungsprozessen (Nature 326, 811 (1987)).<br />
Der katalytische Teil bindet die Substrate F-6P und ATP. ATP nimmt bei höheren<br />
Konzentrationen auch einen (niederaffinen) Bindungsplatz am regulatorischen Teil ein und<br />
wirkt von dort aus als allosterischer Inhibitor. Diese Funktion teilt es mit weiteren endogenen<br />
Energieüberschusssignalen der Zelle (NADH,H + und Citrat). Sind hingegen<br />
Energiemangelsignale (AMP, ADP) vorhanden, so wird das Enzym allosterisch aktiviert.<br />
Solange AMP und ADP vorherrschen, determinieren sie das Geschehen.<br />
Seit längerem ist bekannt, dass PFK1 nicht nur durch eines seiner Substrate (ATP)<br />
inhibierbar ist, sondern auch durch eines seiner Produkte (F-1.6BP) in vitro aktiviert werden<br />
kann ("verkehrtes Enzym"). In der Zelle tritt der letztere Effekt vermutlich nicht auf, da F-
56<br />
Km/Ki<br />
1.6BP durch Aldolasetätigkeit nie die erforderliche "steady-state" Konzentration erreicht.<br />
Relativ neu ist der Befund dass ein Isomeres, das F-2.6BP, ein physiologischer allosterischer<br />
Aktivator ist. F-2.6BP vermittelt Hungersignale (Glucagon, Adrenalin), die vom<br />
Organismus ausgesandt werden.<br />
F-2.6BP ist das Produkt einer weiteren, spezialisierten Phosphofructokinase (PFK II) 14 . PFK II gehört zu den<br />
interkonvertierbaren Enzymen, d.h. ihre Aktivität wird durch Proteinkinase A und damit indirekt durch<br />
hormonelle Signale reguliert. So findet man, dass Glucagon die PFK II der Leber abschaltet, wodurch F-2.6BP<br />
nicht mehr verfügbar ist. Hierdurch kommt der Metabolitenstrom der Glycolyse an PFK1 zum Erliegen. Der<br />
resultierende G-6P Stau wird durch Überführung in Glucose abgebaut, die als Neutralmolekül an den<br />
Blutkreislauf abgegeben werden kann. Das Glucagonsignal "zu geringer Blutzucker" ist damit beantwortet 15 .<br />
Das gegenläufige (Insulin-) Signal "zu hoher Blutzucker" wird offenbar über ein extrem pHabhängiges<br />
Aktivitätsprofil realisiert (Kapitel 3.2). Die Aktivierung der PFK1 beinhaltet nicht<br />
nur Konformationsänderungen der individuellen Untereinheiten, sondern auch Aggregatbildung<br />
zu höheren Oligomeren [(C.R) n ]; dabei scheint der Wert n von der Spezies, auch vom<br />
Organ, abzuhängen.<br />
7.3 Versuch D1: Zur Regulation der Phosphofructokinase (Enzym des Schrittes 3)<br />
Phosphofructokinase spricht auf die Energiebilanz der Zelle an, der Metabolitenfluss durch<br />
die Glycolyse wird bei Umschalten auf aeroben Abbau an dieser Stelle gedrosselt.<br />
Allgemeine Vorbemerkung: als regulatorisches Enzym entspricht PFK nicht den Michaelis-Menten Voraussetzungen<br />
und beginnt nicht mit der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit. Tangenten an den Ursprung können hier nicht über<br />
Programm "V0" ermittelt werden (das M.-Menten-Verhalten voraussetzt). Hier ist zunächst die Steigung des auf die<br />
typische „lagphase“ folgenden linearen Astes zu vermessen und den Rechnungen zugrunde zu legen (siehe aber unter<br />
D3).<br />
Substanzen:<br />
1) Testmischung 4 mM Dithiothreitol<br />
5 mM MgCl 2<br />
50 mM Imidazol-HCl, pH 7.4 (7.2-7.6, in diesem Puffer jedoch keinesfalls<br />
unter 7.1 16 )<br />
2) 150 mM ATP in (1)<br />
3) 150 mM Citrat in (1)<br />
4) 25 mM Fructose-6-phosphat (pH der Lösung kontrollieren!!)<br />
14 Bitte beachten, dass PFK1 und PFK2 keine Isoenzyme im strengen Sinne sind, da sie keine identischen,<br />
sondern nur verwandte Reaktionen katalysieren.<br />
15 Wie bei Tieren, aktiviert F-2.6BP auch bei Pflanzen die Glycolyse und hemmt die Gluconeogenese. Bei<br />
aktiver Photosynthese wird DAP erzeugt und P i verbraucht, wodurch PFK-2 gehemmt wird: die Konzentration<br />
an F-2.6BP nimt ab. Nimmt die Photosynthese hingegen ab, steigt<br />
[F-2.6BP], wodurch die Glycolyse stimuliert wird und die Energieerzeugung übernimmt (Lehninger “Prinzipien<br />
der Biochemie (1994) pp 727).<br />
16 vergl. Kapitel 3.2
57<br />
Km/Ki<br />
5) 4.8 mM NADH,H +<br />
6) Hilfsenzym Glycerin-3-P-Dehydrogenase (5 µl GDH-Kristallsuspension; da PFK das "<br />
Flaschenhalsenzym" der Glycolyse darstellt, sind bei Verwendung des Muskelextraktes<br />
Trisosephosphat-Isomerase und Aldolase als weitere Hilfsenzyme entbehrlich)<br />
7) 100 µl Muskelextrakt als Quelle für Phosphofructokinase<br />
Solange gereinigte Phosphofructokinase erhältlich war (bis 1997) wurden 10-50 µl Kristallsuspension auf 1 ml H 2 O verwendet.<br />
Die Lösung wurde auf 20 mM DTT eingestellt (20 µl einer 1M Lösung von DTT ad 1 ml) 17 . Stabilitätsprobleme werden durch<br />
Verwendung des vollständigen Muskelextraktes umgangen (warum?). Allerdings ist der Extrakt vor Versuchsbeginn von<br />
"störenden" Metaboliten (insbesondere ATP) zu befreien (warum?).<br />
A) Einfluss der ATP-Konzentration 18<br />
Depletieren des Muskelextraktes(ATP): Aufgrund der Versuchsgruppe B ist bekannt, dass<br />
der Muskelextrakt bereits ATP, aber auch Glucose, G-6P, DAP und 3-PG enthält. Bei Zusatz<br />
von GDH und NADH,H + können 3-PG und DAP über den Schritt 3 (Kap. 2.1) in der GDH<br />
Reaktion abgezogen werden; dabei sollte auch ATP umgesetzt werden (Glucokinase-, PFK-<br />
Reaktionen aber auch PGK-"Rückwärtsreaktion"). Verglichen mit dem zugesetzten<br />
Hilfsenzym (GDH) sollte die Wirkung endogener LDH von untergeordneter Bedeutung sein,<br />
damit Neusynthese des ATP zu vernachlässigen sein. Bei Vorversuchen wurde gezeigt,<br />
dass die Depletierung im Pipettierschema beim F-6P-Schritt gelungen ist (Abb. 7.3): Die<br />
Reaktion wird erst durch Zugabe externen ATPs (und nicht schon bei Zugabe von F-6P)<br />
gestartet. Die spezifische PFK-Reaktion verrät sich aufgrund des sich charakteristisch<br />
beschleunigenden Umsatzes (Abbau inhibitorischer ATP-Konzentrationen, Entstehung von<br />
stimulatorischem F-1.6BP, das in der Küvette die Rolle von F-2.6BP übernehmen kann):<br />
Pipettierplan:<br />
Testmischung (1) 2625 2595 2545 2445<br />
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl<br />
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100<br />
NADH,H + (5) 150 150 150 150<br />
- Warten: Depletion -<br />
F-6P (4) 100 100 100 100<br />
- Extinktion stabil? -<br />
ATP (2) 20 50 100 200<br />
17 Phosphofructokinase wird zwischen pH 7 und 8 extrem instabil; nur in Gegenwart von<br />
Substraten/Substratanalogen (2 mM ATP, 10mM Phosphat) bleibt sie bei pH 7 für >10 Minuten unverändert;<br />
andernfalls wird sie innerhalb von 2 Minuten inaktiviert. J. V. Passoneau & O. Lowry (1962) Biochem. Biophys.<br />
Res. Commun. 7, 10-14.<br />
18 K. Uyeda & E. Racker (1965), J. Biol. Chem. 240 4682-4688, Fig. 4
58<br />
Km/Ki<br />
Abb. 7.3: Muskelextrakt wird durch Zugabe von NADH,H + und GDH als Hilfsenzym an ATP, 3-PG und DAP<br />
depletiert. Ausbleiben einer weiteren Reaktion nach F-6P Zugabe zeigt Abwesenheit von ATP. Die PFK-<br />
Reaktion kann dann durch Zugabe von ATP gestartet werden.<br />
Fertigen Sie Diagramme an, in denen Sie die Endkonzentrationen an ATP (mM, Abszisse)<br />
gegen die höchste Reaktionsgeschwindigkeit (∆E/min) auftragen.<br />
- zur Abschätzung des K m -Wertes für ATP verwenden Sie statt 2) bitte ATP-<br />
Lösungen von ca. 5 mM.<br />
Damit können Sie den Bereich erfassen, in welchem Erhöhung der ATP-Konzentration Steigerung der<br />
Umsatzgeschwindigkeit bewirkt<br />
- Ermitteln Sie die präzisen K m und K is- Werte für ATP mit Hilfe des Programmes<br />
Composit<br />
(Option [I]nhibition; [S]ubstratinhibition;<br />
- geben Sie mögliche Gründe an für die "lagphase" zu Beginn der Reaktion;<br />
B) Einfluss von Citrat (3) 19 :<br />
Testm.(1) 2495 2475 2445 2395 2295<br />
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl<br />
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100 100<br />
Citrat (3) - 20 50 100 200<br />
NADH,H + (5) 150 150 150 150 150<br />
F-6P (4) 100 100 100 100 100<br />
- Warten: F-6P-Depletion; NADH,H + ausreichend? -<br />
ATP (2) 150 150 150 150 150<br />
Fertigen Sie Diagramme an, in denen Sie die Endkonzentrationen an Citrat (mM, Abszisse)<br />
gegen die höchste Reaktionsgeschwindigkeit (∆E/min) auftragen.<br />
- Schätzen Sie den K i -Wert für Citrat;<br />
19 Die Citrathemmung tritt nur vor dem Hintergrund einer erhöhten (bereits inhibitorischen) ATP-Konzentration<br />
(8 mM) auf: A. Parmeggiani & R. H. Bowman (1963), Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 268-273, Tab. 1
59<br />
Km/Ki<br />
- Fertigen sie eine Auftragung der Endkonzentration an Citrat (mM; Abszisse)<br />
gegen dessen relative Hemmung an. Ermitteln Sie die Dissoziationskonstante<br />
für Citrat (die hier dessen Inhibitionskonstante gleichen sollte) über das<br />
Programm Composit<br />
(Option [S]ubstratkonzentration [H]yperbol); das Verfahren wird unter D3 für ein<br />
anderes (komplexeres) Inhibitionssystem ausführlich beschrieben<br />
Versuch D2: Phosphofructokinase, ein kooperatives Enzym (?) 20 :<br />
Wie unter 7.1 gezeigt, wird PFK jenseits einer bestimmten ATP-Konzentration zum<br />
allosterischen, d.h. positiv kooperativ arbeitenden Enzym. Dieser Effekt soll bei konstanter<br />
ATP-Konzentration und steigender Gabe an F-6P nachvollzogen und später durch<br />
Computer-Unterstützung mit Hilfe des Programms Composit ausgewertet werden.<br />
Substanzen (außer jenen zu D1):<br />
1a) Testmischung 50 mM Glycylglycin (K + -Salz, pH 7.1)<br />
0.01% Albumin<br />
14 mM Cystein<br />
0.4 mM MgCl 2<br />
Pipettierplan: steigende F-6P Konzentrationen<br />
Testmisch.(1a) 2599 2598 2590 2588 2585 2580 2575 2545 2495 2445 2395<br />
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl<br />
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100<br />
NADH,H (5) 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150<br />
F-6P (4) 1 2 5 7 10 15 20 50 100 150 200<br />
- Warten: F-6P-Depletion -<br />
ATP (2) 21 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150<br />
20 J. V. Passonneau & O. H. Lowry (1962) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7, 10-15, Fig. 2; ATP: 2.3 mM;<br />
F-6P: 0.1-3 mM. T. E. Mansour und C. E. Ahlfors (1968) J. Biol. Chem. 243, 2523-2533 Fig. 7; ATP: 1 mM; F-<br />
6P: 0.1-20 mM in Testmischung 1a (Kooperativität bei pH 6.9 aber nicht bei pH 8.2).<br />
21 Hier könnte es sinnvoll sein, mindestens mit jener ATP-Konzentration zu arbeiten, die im Pipettierplan zu<br />
Versuch D1-A die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ergab. WARUM??
60<br />
Km/Ki<br />
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren der ATP-Lösung gestartet, und der Abfall der<br />
E 340 wird registriert. Verwenden Sie Testmischung 1a und variieren Sie den pH-Wert (6.9-<br />
7.1; Literaturvorgabe ist pH 6.9!!), die [ATP]-Basiskonzentration bzw. den [F-6P]-Konzentrationsbereich<br />
(Messpunkte zwischen 1 und 20 µl an F-6P), falls das Phänomen sich mit<br />
den Vorgaben nicht deutlich zeigt.<br />
Vorschlag: Mit dem Pipettierplan kann aufgrund der zahlreichen kritischen Parameter nur<br />
eine Anregung gegeben werden. Beginnen sie bei der höchsten F-6P-Konzentration, da hier<br />
die Kinetik am wenigsten Probleme bereiten sollte. Dann F-6P Konzentration zunächst in<br />
Zweierstufen senken, bis der problematische Bereich erreicht wird. Schließlich den<br />
messbaren Bereich – insbesondere bei niedrigen F-6P Konzentrationen – so gut wie möglich<br />
abdecken. Falls die Depletion zu lange dauert: Stammlösung anlegen und inkubieren, dann<br />
vermessen und aliquotieren.<br />
- können Sie das in Lehrbüchern häufig zitierte kooperative Verhalten der PFK<br />
nachvollziehen?<br />
- ergibt sich ein anderes Ergebnis, wenn Sie versuchen, Tangenten an den<br />
wahren Ursprung (t = 0) anzulegen und dabei die "lag"-Phase bei Ihrer<br />
Auswertung zu berücksichtigen?<br />
Tangenten an diese Art Kinetik lassen sich im Prinzip (!) über Composit (Option<br />
[S]ubstrat; [P]rogress curve) erzeugen, vergleiche auch Kapitel 9.2.2. Ein Beispiel-file<br />
lässt sich über ṕrogkuŕ aufrufen<br />
- diskutieren Sie Unterschiede, die aus beiden Tangentenverfahren (linearer Ast<br />
bzw. Steigung der "lag"-Phase) resultieren und diskutieren Sie ggf. wie hier ein<br />
kooperatives Phänomen zustande kommt.<br />
Abb. 7.4 a: So weit kamen wir 2002 und 2004: im<br />
unteren Konzentrationsbereich gibt es zu wenige<br />
verlässliche Messpunkte, um eine Entscheidung<br />
"kooperativ oder nicht" zu treffen.<br />
Abb. 7.4 b: ...und so weit 2003: der untere<br />
Konzentrationsbereich ist gut belegt und nur durch<br />
kooperative Bindung zu erklären. Nahe der Sättigung<br />
wären einige Messpunkte von Vorteil gewesen.<br />
Angleichung in "Composit" (Adair) liefert:<br />
Vmax = 7<br />
K(1) = 1300<br />
K(2) = 1.3.<br />
7.5 Versuch D3: Pyruvatkinase, ein kooperatives Enzym (?):
61<br />
Km/Ki<br />
Carminatti et al. (1971) J. Biol. Chem. 246, 7284-7288; zur Zeit nicht durchgeführt!<br />
Alle Gruppen, die nicht D1B oder D2 durchführen<br />
Neben PFK ist die PK, ein K + /Mg ++ -abhängiges Tetramer, das zweite hauptsächliche regulatorische Enzym in der Glycolyse. Wie<br />
die PFK spricht es auf die Energiebilanz der Zelle an und unterliegt einer typischen 'feed-forward' Aktivierung durch F-1.6BP (warum?).<br />
Enzyme aus vielen Organismen binden ihr Substrat, PEP, in kooperativer Weise; für das Skelettmuskelenzym wurde dies nicht<br />
beschrieben. Erste Hinweise dafür, dass dennoch ein allosterisches Protein vorliegt, ergaben sich über die Untersuchung eines relativ<br />
spezifischen Inhibitors, Phenylalanin (vergl. Kap. 3.5).<br />
Substanzen<br />
1) Testmischung 0.1 M Tris x HCl, pH 7.8<br />
0.1 M KCl<br />
10 mM MgCl 2<br />
2) 5 mM Phosphoenolpyruvat (PEP) in 1)<br />
3) 50 mM ADP in 1)<br />
4) 150 mM Phenylalanin (Phe) in 1)<br />
5) 4.8 mM NADH,H +<br />
6) Enzym Pyruvatkinase; Kristallsuspension etwa 1:10 verdünnt.<br />
Geeignete Verdünnung in 1) ausprobieren und optimieren, so dass in Abwesenheit von Phe eine gut auswertbare Kinetik erhalten wird<br />
7) Hilfsenzym Lactatdehydrogenase (LDH) als Kristallsuspension<br />
Pipettierplan: steigende Phe Konzentrationen<br />
Testmisch.(1) 2690 2685 2680 2670 2640 2540 2490 2440<br />
Pyruvat Kinase (6) 5 5 5 5 5 5 5 5<br />
Hilfsenzym (7)<br />
je 5 µl LDH<br />
Phe - 5 10 20 50 150 200 250<br />
ADP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100<br />
NADH,H + (5) 100 100 100 100 100 100 100 100<br />
PEP (2) 100 100 100 100 100 100 100 100<br />
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren von 100 µl an PEP gestartet und der Abfall der E 340 wird registriert. Tragen Sie die Phe-<br />
Konzentration gegen die relative Hemmung (0 für die Reaktion ohne Phe; maximal 1 für die vollständig gehemmte Reaktion) auf und<br />
behandeln Sie die erhaltene Kurve als Bindungskurve des Inhibitors.<br />
Falls sich die Kooperativität nicht deutlich zeigt, bitte deren pH-Abhängigkeit berücksichtigen. Anhand Abb. 7.4 ist zu sehen, dass der<br />
typische kooperative (sigmoide) Verlauf nur dann deutlich wird, wenn der Bereich niedriger [Phe] Konzentration hinreichend abgedeckt ist.<br />
Ggf. weitere Verdünnungsschritte dazunehmen.<br />
Abb. 7.4 (nach einem<br />
Praktikumsprotokoll): Phenylalanin ist<br />
kooperativ bindender Inhibitor der<br />
tetrameren Muskel-Pyruvatkinase (PK).<br />
Auftragung der sigmoiden<br />
Sättigungskurve in Form eines 'Hill-Plot'<br />
einen Hillkoeffizienten n H = 1.7. Dieser<br />
Kooperativitätsparameter ähnelt dem<br />
Hämoglobins, das als Prototyp eines<br />
kooperativen Proteintetramers gilt.<br />
ein<br />
Die<br />
ergibt<br />
des<br />
- aus dieser 'Bindungskurve'lassen sich mit Hilfe des Programms Composit 'K m -Werte' [K(1) und K(2)] ermitteln, die hier<br />
allerdings als K i -Werte zu interpretieren sind;<br />
- wie groß sind das Verhältnis K(1)/K(2) bzw. der Hill-Koeffizient, n H , für die Bindung von Phe an PK (Programme<br />
Composit oder MMenten)?<br />
8 BESTIMMUNG VON K m - UND K i -WERTEN
62<br />
Km/Ki<br />
8.1 Sättigungsphänomene: der ES-Komplex<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Michaelis-Menten-Theorie<br />
Die normalen Prinzipien chemischer Reaktionskinetik treffen naturgemäß auch auf enzymatisch<br />
katalysierte Reaktionen zu, jedoch sind einige Besonderheiten zu beachten, die<br />
A<br />
B<br />
[Substrat]<br />
sich unter dem Begriff "Sättigungsphänomen" zusammenfassen lassen:<br />
Abb. 8.1: Enzym-Substratkomplex (ES) und das Sättigungsphänomen<br />
A - Sättigungsfunktion bei Behandlung eines Enzyms bei niedriger (1) und hoher (2) Substrat-mit<br />
steigenden Substratkonzentrationen;<br />
B - simplistische graphische Ermittlung der kinetischen Parameter K m und V max nach Michaelis und<br />
Menten (1913). 22<br />
Abb. 8.1A zeigt den Enzym-Substratkomplex bei niedriger (1) und hoher (2)<br />
Substratkonzentration. Bei niedriger Substratkonzentration ist das Enzym von<br />
wenigen Molekülen S umgeben und die Wahrscheinlichkeit, dass ein Molekül auf<br />
das aktive Zentrum trifft ist geringer als bei hoher Substratkonzentration. Mit<br />
steigender S-Konzentration wird die Zeit, die verstreicht bis ein neues Molekül S auf<br />
eine freie Bindungsstelle trifft, immer kürzer, bis schließlich jede freiwerdende<br />
Bindungsstelle sofort wieder besetzt werden kann. Unter dieser Bedingung ist das<br />
22 Bitte, untersuchen Sie mit den Ihnen zur Verfügung stehenden Mitteln (Programme<br />
Composit, KmVm, MMenten oder Enzfitter), ob Michaelis und Menten diese Hyperbel (die den<br />
Messwerten der Abb. 4.1 entspricht) hinsichtlich der Parameter V max (3.7) und K m (0.015) korrekt<br />
ausgewertet haben: die [S], v o -Werte für diese Graphik wurden unter "MICHAELI.HYP"<br />
abgespeichert. Überprüfen Sie auch die entsprechenden Darstellungen in jedem beliebigen<br />
Lehrbuch. Was lernen Sie über die Ablesbarkeit von K m und V max aus Sättigungskurven bzw. über die<br />
Unfehlbarkeit berühmter Autoren?<br />
Bitte beachten Sie anhand der Datei "MICHAELI.HYP" die Regeln, nach denen Dateien zur<br />
Bearbeitung im Computer eingegeben werden müssen. Die obligatorische Reihenfolge lautet stets<br />
kleinster X-Wert - erster Y-Wert;<br />
zweiter (größerer) X-Wert - zweiter Y-Wert etc.<br />
eine Eingabe des Wertes 0 - 0 ist nicht zulässig bzw. nötig. X-Werte sind typischerweise<br />
Zeitpunkte oder Substratkonzentrationen und Y-Werte Extinktionswerte.
63<br />
Km/Ki<br />
Enzym "gesättigt", die Umsatzgeschwindigkeit hat ihr Maximum erreicht und hängt<br />
nur noch von der Zahl der Enzymmoleküle (genauer: aktiven Zentren) sowie der<br />
"turnover number" (d.h. der molaren Aktivität nach Kap. 4.10) ab.<br />
In Abb. 8.1B sind diese Verhältnisse in einem Koordinatensystem dargestellt.<br />
Bei niederen Konzentrationen an S ist die Anfangsgeschwindigkeit des enzymatischen<br />
Umsatzes (v bzw. v o ) nahezu proportional der Substratkonzentration, d.h. die<br />
Reaktion ist erster Ordnung bezogen auf das Substrat. Bei steigenden<br />
Substratkonzentrationen steigt v zunächst unterproportional (gemischte Ordnung,<br />
"mixed order") um dann in den Bereich der Sättigung überzugehen, in dem eine<br />
Reaktion nullter Ordnung vorliegt. Alle Enzyme zeigen das Sättigungs-Phänomen,<br />
unterscheiden sich jedoch dramatisch in der Substratkonzentration, bei der diese<br />
erreicht ist. Diese Beobachtung führte A.J. Brown und V. Henri zur Hypothese, dass<br />
Enzym und Substrat einen reversiblen Komplex ES ausbilden, der einen wesentlichen<br />
Schritt der enzymatischen Katalyse darstellt (heute weiß man, dass in diesem<br />
Komplex das Substrat in einen kurzlebigen Übergangszustand überführt, d.h.<br />
aktiviert werden kann).<br />
1913 entwickelten L. Michaelis und M. L. Menten eine in ihren Grundprinzipien<br />
heute noch gültige Theorie; diese wurde später durch G.E. Briggs und J.B.S. Haldane<br />
ausgedehnt und besser fundiert. Die Theorie ermöglicht die quantitative Analyse<br />
vieler Aspekte der Enzymkinetik und -inhibition und liegt auch dem<br />
Computerprogramm "MMenten" zugrunde, welches verschiedene graphische<br />
Auswertungsverfahren auf dieser Basis illustriert.<br />
8.2 Katalytische Effizienz: das k cat /K m -Kriterium<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Fließgleichgewicht<br />
Unter Berücksichtigung der Reversibilität wäre eine enzymatische Reaktion wie folgt<br />
zu formulieren:<br />
Bei enzymkinetischen Messungen werden "steady-state" Bedingungen (keine Änderung<br />
von [ES]) dadurch angenähert, dass Messungen auf den Zeitpunkt t=0 ([S]=[S o ])<br />
extrapoliert werden. Wie im "steady state" spielt hier die Rückwärtsreaktion (k -3 ) noch<br />
keine Rolle. Da die chemische Umsetzung ES -> EP der langsamste (d.h.<br />
geschwindigkeitsbestimmende) Schritt ist, wird k 3 gegenüber k 2 vernachlässigt, woraus die<br />
allseits anzutreffende Beziehung
64<br />
Km/Ki<br />
resultiert.<br />
Wenn Substratkonzentrationen den K m -Wert stark überschreiten, entspricht die<br />
Reaktionsgeschwindigkeit (V max ) dem Produkt k 2 ×[E o ], da die Gesamtheit vorhandenen<br />
Enzyms (E o ) als ES-Komplex vorliegt. Für den Fall, dass k 2 den limitierenden Schritt<br />
kennzeichnet (und damit k cat = k 2 wird) wird diese Konstante zur "molaren Aktivität",<br />
"Wechselzahl" oder "Turnover-Number" (Einheit: mole Substrat /(mol . Enzym Zeit).<br />
Da die meisten Enzyme unter physiologischen Bedingungen nicht mit Substrat<br />
gesättigt sind, wird nicht V max , sondern nur ein Wert v=k 2 ×[ES] erreicht. Damit stellt sich die<br />
Frage nach einem sinnvollen Effizienzparameter. Unter der Voraussetzung, dass [S]
65<br />
Km/Ki<br />
Abb. 8.3: Zur Abschätzung von k cat /K m . Die Tangente an<br />
den Urspung hat eine Steigung V max /K m . Wird V max<br />
als molare Aktivität ausgedrückt (d.h. als V max /E o ),<br />
so beträgt die Steigung k cat /K m .
66<br />
Km/Ki<br />
8.3 Ableitung der Michaelis-Menten Beziehung
67<br />
Km/Ki<br />
8.4 Nichtlinearen Regression: Angleichung der Michaelis-Menten-Beziehung<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Regressionsanalyse<br />
Regressionsanalysen sind Techniken, mit denen für eine Gleichung y = f(x) die Parameter<br />
so angeglichen werden, dass minimale Abweichungen zwischen experimentellen und<br />
kalkulierten Werten entstehen. Für diesen Fall wird die gewichtete Summe der<br />
Fehlerquadrate (SSQ oder χ 2 genannt) minimiert. Zur Wichtung dient die Varianz (σ i ) des<br />
Datenpunktes; je größer diese ausfällt, desto weniger trägt der betreffende Punkt zur<br />
Analyse bei:<br />
χ<br />
2 i<br />
=Σ∆ [ yi<br />
/ σ ]<br />
2<br />
i<br />
Die Regressionsanalyse ist die leistungsfähigste Methode zur Datenanalyse ist, setzt aber<br />
voraus, dass nur y (Reaktionsgeschwindigkeit) und nicht x (Substratkonzentration) einem<br />
Fehler unterliegt.<br />
Lineare Regression lässt sich nur auf lineare oder linearisierbare Funktionen<br />
anwenden. Die vertraute Lineweaver-Burke-Beziehung ist zwar eine algebraisch korrekte<br />
Umformung der Michaelis-Menten Beziehung, ihre Anwendung liefert aber nur korrekte<br />
Ergebnisse, wenn die Messwerte fehlerfrei sind. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass<br />
sich die Realität nur mit einer erweiterten Michaelis-Menten Beziehung<br />
V max[ Si<br />
]<br />
vi<br />
= + ei<br />
mit e i als Fehlerparameter, beschreiben Km + [ lässt. S ] ( 1<br />
Diese )<br />
Gleichung lässt sich nicht mehr<br />
linearisieren, woraus sich die Forderung nach nichtlinearer Regressionsanalyse ergibt.<br />
i<br />
Nichtlineare Regression ermöglicht die Anpassung von Daten an jede Gleichung der<br />
Form y = f(x). Da diese Gleichungen Kurven definieren, werden die Begriffe nichtlineare<br />
Regression und ćurve fittinǵ zumeist synonym gebraucht. Bei nichtlinearen<br />
Gesetzmäßigkeiten ergibt sich eine Komplikation dadurch, dass die zu optimierenden<br />
Parameter nicht direkt ermittelt werden können: alle Kalkulationen gehen zwangsläufig von<br />
Schätzwerten aus, so dass jede nichtlineare Regressionsanalyse ein iteratives Verfahren<br />
darstellt. Ob diese Schätzwerte vernünftig waren, zeigt sich im nachhinein dadurch, dass<br />
verschiedene Anfangsschätzungen zum gleichen Endergebnis führen. Das Verfahren geht<br />
ursprünglich auf Gauss zurück. Unsere Programme arbeiten mit dem Algorithmus nach<br />
Marquart, der sich bei größerer Abweichung der Schätzwerte als toleranter erweist.<br />
Standard-Regressionsanalysen setzen voraus, dass Fehler einer Normalverteilung folgen. Ausreißer lassen<br />
sich aufgrund des Algorithmus von Mosteller und Tukey (1977) unterdrücken. Dies wird durch Anwendung<br />
eines weiteren Wichtungsfaktors (1 für Punkte geringer Abweichung, 0 für extreme Ausreißer) erreicht und<br />
als "bisquare weighting" bezeichnet.<br />
v i<br />
8.5 Linearisierung der Michaelis-Menten Beziehung
68<br />
Km/Ki<br />
1)<br />
V max × [ S]<br />
v =<br />
Km + [ S]<br />
8.5.1 Lineweaver und Burk (doppelt reziproke Auftragung)<br />
Bildung des Kehrwertes von (1) und Trennung des Bruchs auf der rechten Seite ergibt<br />
2)<br />
1 Km 1<br />
= +<br />
v V max S V<br />
y = m × x + b<br />
1<br />
max<br />
________________________________<br />
1<br />
[ S]<br />
= 0:<br />
1 v<br />
= 1 V max ;<br />
1 0 1 1 V max<br />
:<br />
1 1<br />
v<br />
=<br />
[ S] = − ;<br />
V max Km [ S]<br />
= −<br />
Km<br />
8.5.2 Eadie-Hofstee (oben) und Scatchard Auftragung (unten)<br />
Multiplikation beider Seiten von (1) mit dem Nenner liefert<br />
3) vS [ ] + vKm=<br />
Vmax[ S]<br />
Division beider Seiten von (3) durch Km[S]:<br />
4)<br />
5)<br />
v +<br />
Km<br />
v<br />
[ S ] = max VKm<br />
v 1 =−<br />
[ S]<br />
Km v max<br />
+<br />
VKm<br />
y = m × x + b<br />
______________________________________<br />
v<br />
[ S ]<br />
= 0: v = V max<br />
v = 0:<br />
v V max<br />
[ S ]<br />
=<br />
Km
69<br />
Km/Ki<br />
8.6 Parametervergleich: Bindungsmessungen und Enzymkinetik<br />
8.7<br />
Messung im thermodynamischen kinetische Messung<br />
Gleichgewicht (Bindungsmessung) (Enzymkinetik)<br />
r, Zahl besetzter Bindungsplätze v, Umsatzgeschwindigkeit<br />
n, Zahl vorhandener Bindungsplätze V max , maximale Umsatzgeschwindigkeit<br />
K d , Dissoziationskonstante [mol/l] K m , Michaeliskonstante [mol/l]<br />
L, Konzentration an freiem Liganden S, Substratkonzentration<br />
Mit diesen Konversionen lassen sich alle Gleichungen/Auftragungen der<br />
Enzymkinetik für Protein Ligandenwechselwirkungen einsetzen und vice versa.<br />
8.7 Zur Auswertung emzymkinetischer Daten: Merkmale verschiedener Plots<br />
Hans Bisswanger, "Theorie und Methoden der Enzymkinetik", Verlag Chemie (1979<br />
8.7.1 Computergestützte Analyse<br />
Die Bestimmung der Parameter K m (K d ) und V max (n) aus hyperbolischen Sättigungsfunktionen<br />
erfolgt heute zweckmäßigerweise mit Computerunterstützung, d.h. durch<br />
nichtlineare Regressionsanalyse. Eine einfache Analyse dieses Typs findet sich in<br />
den Programmen "KmVm" und "MMenten"; sich überlagernde Hyperbeln können<br />
durch das höherentwickelte Programm "Composit" analysiert werden.<br />
8.7.2 Bedeutung konventioneller Auftragungen<br />
Zur Datenrepräsentation und für eine vorläufige graphische Analyse eignen sich<br />
lineare Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung, wie sie unter 8.4<br />
abgeleitet wurden. Aufgrund unvermeidbarer Messfehler beinhalten alle diese<br />
graphischen Verfahren bei der Auswertung einiges an Subjektivität, was man sich<br />
am besten mit Hilfe der Graphikprogramme "Enzpack" oder "MMenten" 23<br />
veranschaulicht. Dort und bei Inspektion der Abbildung 8.6-a wird man folgendes<br />
feststellen:<br />
23 Abbildung 8.4 (umseitig): Möglichkeiten der Datentransformation und Datenausgabe im<br />
Programm "MMenten". Das Diagramm "V vs. S plot" zeigt die Messdaten (bei gleichbleibenden<br />
Konzentrationsunterschieden auf der S-Achse); die weiteren Diagramme zeigen Transformationen für<br />
diese Messpunkte, wie sie z.B. unter 'files' im Programmpaket beschrieben werden.
70<br />
Km/Ki
71<br />
Km/Ki<br />
Lineweaver-Burk Diagramm (doppelt-reziproke Auftragung)- zur Datenrepräsentation meist<br />
verwendet, zur Auswertung jedoch am wenigsten verlässlich. Kleine Fehler in v ergeben bei kleinen<br />
S-Werten eine große Abweichung in 1/v, bei großen S-Werten ist diese eher zu vernachlässigen. Die<br />
Autoren der Methode haben die Unsicherheit großer 1/v Werte betont und darauf hingewiesen, dass<br />
diese grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender haben dies zumeist ignoriert. Wo<br />
möglich sollte dieses Verfahren zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden,<br />
vorzugsweise durch das<br />
Hanes(-Wilkinson) Diagramm (Hanes-Woolf Diagramm)- Bestmögliche Auftragung dieses Typs.<br />
Fehler in [S]/v sind eine weit bessere Annäherung der Fehler in v. Aufgrund einer unverfälschten<br />
Spreizung der Messpunkte entlang der S-Achse wird das Ergebnis durch einzelne Ausreißer<br />
prinzipiell weniger verfälscht. Nur bei dieser Auftragung kann auch eine Datenoptimierung durch<br />
lineare Regression sinnvoll sein. K m ist direkt ablesbar.<br />
Eadie-Hofstee Diagramm- Verdient eine Mittelstellung. Der Fehler wächst mit v/[S]. Da v bei beiden<br />
Koordinaten eingeht, konvergieren alle Abweichungen zum Ursprung.<br />
Scatchard-Diagramm- gleicht dem vorigen (Achsen sind vertauscht) und wird zumeist zur<br />
Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle kinetischer Daten) angewendet. Scatchard- und<br />
Eadie-Hofstee Diagramme gelten als beste Werkzeuge zur Diagnose kooperativer Phänomene. Im<br />
Falle negativer Kooperativität oder nicht-identischer, isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver<br />
Verlauf mit linearem Endast (Abb. 8.6.2). Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten (K d bzw<br />
K m ) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze (aktiven Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der x-<br />
Achse abzulesen<br />
Hill-Diagramm- klassische Methode für die Bestimmung der Kooperativität eines Proteins (Enzyms).<br />
Die Graphik setzt Kenntnis von V max (bzw. n) voraus. Die Auftragung von log [S] vs. log v/(V max -v)<br />
bzw. log [L] vs log r/(n-r) ist eine Gerade der Steigung 1 (n H =1), wenn die Bindungsplätze<br />
voneinander unabhängig sind. Bei kooperativen Systemen kann die Steigung am Nullpunkt (der “Hill-<br />
Koeffizient”) theoretisch der Zahl der Untereinheiten (n) gleichen, wird aber praktisch darunter<br />
bleiben. Falls die individuellen K m (K d ) Werte nicht durch Tangenten an die 45 o Enden der Kurve<br />
extrapolierbar sind, ist n H als Maß der Kooperativität einzusetzen; nur für n H =1 ist der Nulldurchgang<br />
gleich ln K m (bzw. K d ). Für Hämoglobin (n = 4), das als klassisches, hochkooperatives Protein gilt,<br />
wurde n H zu 2.8 bestimmt. Messdaten können von den Programmen "MMenten" und "Composit" aus<br />
abgerufen bzw. demonstriert werden (Datenfiles "EX2 bis EX5).<br />
Abb. 8.5: Übersicht der gebräuchlichsten Diagramme zur Darstellung enzymkinetischer Daten. Es<br />
sind jeweils 10 Messwerte mit gleichbleibenden Differenzen hinsichtlich der Substratkonzentration<br />
und den Grenzen für den konstanten absoluten Fehler eingezeichnet. Diese erfahrungsgemäß<br />
realistische Annahme impliziert einen mit abnehmender Genauigkeit (Substratkonzentration)<br />
zunehmenden relativen Fehler. Ferner ist angegeben, wie die Konstanten abzulesen sind. Alle<br />
Kalkulationen und die meisten Graphiken können mit den Computerprogrammen "MMenten" bzw.<br />
"Enzpack" nachvollzogen werden. Die in mancher Hinsicht überlegene direkt-lineare Auftragung<br />
wird unter 8.7 beschrieben.
72<br />
Km/Ki<br />
8.7.3 Allosterie und Kooperativität<br />
nach P. Karlson, "Kurzes Lehrbuch der Biochemie"<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Allosterie<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Kooperativität<br />
Die Veränderung der Bindungsaffinität eines Proteins zu kleinen Molekülen (beim<br />
Hämoglobin: des Sauerstoffmoleküls) durch Beeinflussung der Raumstruktur<br />
bezeichnet man auch als allosterische Regulation oder kurz als Allosterie.<br />
Allosterische Effekte spielen auch eine bedeutende Rolle bei der Regulation der<br />
Enzymaktivität.<br />
Der Begriff „Allosterie“ wird in der Literatur unterschiedlich gebraucht. Er<br />
wurde für Enzyme benutzt, die bestimmte Effektoren an anderer Stelle binden als<br />
das Substrat; (daher rührt der Name allos = anders, steros = Ort), und bedeutete<br />
zunächst die Veränderung der Raumstruktur unter Beeinflussung des aktiven<br />
Zentrums des Enzyms. Manche Autoren meinen, dass für den allosterischen Effekt<br />
auf jeden Fall eine kooperative Wechselwirkung zwischen Untereinheiten notwendig<br />
ist; danach dürften bei monomeren Proteinen keine allosterischen Effekte auftreten.<br />
Indessen kennt man auch bei solchen Proteinen Veränderungen der Tertiärstruktur<br />
durch kleine Moleküle, die einen Einfluss auf das aktive Zentrum haben können. Es<br />
hat sich daher eingebürgert, auch diese Änderungen der Raumstruktur unter den<br />
Begriff der Allosterie zu subsummieren. Nehmen Sie das Beispiel der<br />
Phosphofructokinase: jede Polypeptidkette ist hier als Fusion zweier Untereinheiten<br />
(C und R) zu sehen. Jede dieser Untereinheiten bindet ATP, C in seiner Eigenschaft<br />
als Substrat (Coenzym) und R in seiner Eigenschaft als allosterischer Inhibitor.<br />
Abb. 8.6.1: Schematische Darstellung (positiver) Kooperativität am Beispiel der<br />
Hämoglobinuntereinheiten während der Sauerstoff-aufnahme. Die ovalen Formen entsprechen der<br />
Konformation mit niedriger Affinität, die eckigen Formen der Konformation mit hoher Affinität. Die<br />
beiden ersten Os-Moleküle werden vermutlich an die «-Ketten gebunden; alsdann erfolgt eine<br />
Konformationsänderung, bei der alle vier Untereinheiten in die Konformation mit hoher Affinität<br />
übergehen, und die beiden letzten Sauenstoffe werden in rascher Folge aufgenommen. Dadurch<br />
erklärt sich die große Steilheit der Sauerstoffbindungskurve im mittleren Abschnitt.<br />
8.7.3.1 Definition und Darstellung kooperativer Bindungsphänomene
73<br />
Km/Ki<br />
1 Man unterscheidet<br />
- Enzyme vom Michaelis-Menten Typ (2)<br />
- kooperativ arbeitende Enzyme (3.1 und 3.2)<br />
2 Michaelis-Menten Enzyme ergeben eine hyperbolische Sättigungsfunktion, die<br />
mit Hilfe der gängigen Linearisierungsverfahren hinsichtlich K m und V max<br />
analysiert werden kann.<br />
- im Hill-Diagramm resultiert eine Gerade mit 45 Grad Steigung (n H = 1); die<br />
Abszisse wird bei K m geschnitten<br />
- die Gruppe umfaßt monomere Enzyme und oligomere Enzyme mit<br />
unabhängig operierenden Untereinheiten (Beispiel: LDH).<br />
3 Kooperativ arbeitende Enzyme ergeben keine Geraden in den gängigen<br />
Linearisierungsverfahren (die hyperbolisches Verhalten voraussetzen)<br />
3.1 Enzyme mit positiver Kooperativität ("sigmoides Verhalten") lassen sich durch<br />
zwei K m -Werte und einen V max -Wert charakterisieren.<br />
- Es gilt: K m (1) > K m (2)<br />
- im Hill-Diagramm resultiert eine Funktion, deren Steigung am Abszissenschnittpunkt<br />
>45 o ist (n H >1); die Verlängerung ihrer terminalen 45 Grad-Äste<br />
gibt Abszissenschnittpunkte bei K m (2) bzw. K m (1)<br />
3.2 Enzyme mit negativer Kooperativität ("pseudohyperboles Verhalten") lassen<br />
sich gleichfalls durch zwei K m -Werte und einen V max -Wert charakterisieren.<br />
- Es gilt: K m (1) < K m (2)<br />
- im Hill-Diagramm resultiert eine Funktion, deren Steigung am Abszissenschnittpunkt<br />
74<br />
Km/Ki<br />
Abb. 8.6.2: Drei grundsätzlich verschiedene Sättigungsfunktionen (A, B, C), Versuche zu ihrer<br />
Angleichung (zweite und dritte Zeilen) und zu ihrer Linearisierung (vierte und fünfte Zeile). Nur die<br />
Hyperbel (A) lässt sich linearisieren. Die Funktionen A (Summe zweier identischer Hyperbeln) und C<br />
(Summe zweier unterschiedlicher Hyperbeln), nicht aber die Funktion B erlauben eine Angleichung<br />
über die Option ́double hyperbolić. A repräsentiert ein Michaelis-Menten Enzym, die Funktionen B<br />
und C entstehen u.a. durch Kooperativitätsphänomene, C auch aufgrund der parallelen Arbeit von<br />
Isoenzymen.
75<br />
Km/Ki<br />
8.8 Soforttest für Messwerte: die direkt-lineare Auftragung<br />
R. Eisenthal und A. Cornish-Bowden (1974) Biochem. J. 139, 715-720<br />
A. Cornish-Bowden und R. Eisenthal (1974) Biochem. J. 139, 721-730<br />
F. de Miguel Merino (1974) Biochem J. 143, 93-95<br />
A. Cornish-Bowden (1975) 149, 305-312<br />
A. C. Storer, M. G. Darlison und A. Cornish-Bowden (1975) Biochem. J. 151, 361-367<br />
M. Markus, B. Hess, J. H. Ottaway und A. Cornish-Bowden (1976) FEBS Lett. 63, 225-230<br />
A. Cornish-Bowden und R. Eisenthal (1978), Biochim. Biophys. Acta 523 268-272<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Enzymkinetik<br />
Für die Ermittlung von K m -Werten bzw. Inhibitionsmustern ist es essentiell, jede<br />
gemessene Anfangssteigung sofort (!!!) auf ihr Zutreffen zu überprüfen. Als Vortest<br />
kann das Einzeichnen in ein v vs. S-Diagramm uneingeschränkt empfohlen werden.<br />
Die S-Werte sind vor Versuchsbeginn bekannt (eingestellte Substratkonzentrationen!),<br />
während der Versuchsreihe ist dann nur der Ordinatenwert für v (bzw. die<br />
Anfangssteigung in beliebigen Einheiten) nachzutragen. Im Gegensatz zu normalen<br />
Auftragungen werden die Messwerte also nicht als Punkte dargestellt, sondern in<br />
Form von Linien, die sich im günstigsten Fall in einem gemeinsamen Punkt<br />
schneiden. Der Demonstration im Programm "Enzpack" (Option E) können Sie entnehmen,<br />
dass sich dies aus der Geometrie<br />
der klassischen Hyperbel ergibt.<br />
Abb. 8.7: Beziehungen zwischen einer Hyperbel und<br />
ihren Asymptoten.<br />
For a rectangular hyperbola through the origin, given by<br />
v=V max . [S]/K m +[S], the asymptotes are [S]=-K m and v=V max ,<br />
and they intersect at the point (-K m , Vmax) in the second<br />
quadrant. Any line through this point intersects at the [S] and<br />
v axes at points [S i ], 0 and 0, v i that correspond to a point<br />
([S i ], v i ) on the hyperbola.' Darstellung nach F. de Miguel<br />
Merino; nach Cornish-Bowden befindet sich die Hyperbel im<br />
zweiten, die Schnittpunkte im ersten Quadranten.<br />
Im direkt-linearen Plot wird die Fehlerbehandlung<br />
weitgehend vereinfacht: die Linien im zweiten<br />
Quadranten werden mehr oder weniger um einen<br />
Punkt<br />
streuen. Mittelwertsbildung gibt dann die<br />
wahrscheinlichen Werte für die Parameter K m und<br />
V max . Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte<br />
(nicht identisch mit deren Standardabweichung!)<br />
können Ausreißer leicht identifiziert und sog. "medians" 24 abgelesen werden; dies erledigen auch die<br />
Programme "Enzpack" und MMenten".<br />
24 'median': derjenige Messpunkt, zu dessen rechter bzw. linker Seite sich die gleiche Anzahl<br />
weiterer Messpunkte befindet. 'Medians' statt 'means' (Mittelwerten) sind stets zu bevorzugen, wenn<br />
die Fehlerverteilung unsymmetrisch ist; 'Ausreißer' beeinflussen das Ergebnis dann nicht. Existiert<br />
eine gerade Zahl an Messpunkten (bzw. Schnittpunkten im direkt-linearen Diagramm), so gibt es<br />
zwangsläufig zwei 'medians'.
76<br />
Km/Ki<br />
.9 Enzymhemmungen<br />
in Anlehnung an: Klaus Dose, "Biochemie - eine Einführung", C Springer-Verlag (1980), S. 87 f.<br />
Wiedergabe der Abbildungen mit freundlicher Genehmigung des Verlages. Neuauflagen 1991, 1996<br />
Ergänzt durch Gerhard Michal, Biochemical Pathways (1999);<br />
http://de.wikipedia.com/Enzymhemmung<br />
Der Einfluss eines Inhibitors I auf den K m- bzw V max -Wert einer enzymkatalysierten<br />
Reaktion kann zur Charakterisierung des Hemmtyps herangezogen werden.<br />
Alternativ kann das Verhältnis des K i -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes<br />
EI) und des K is -Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EIS) zur<br />
Klassifizierung dienen<br />
Abb. 8.8 Inhibitionstypen.<br />
A - Ḿixed-typé. Der Inhibitor bindet sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym-<br />
Substratkomplex. K m und V max werden nicht erreicht. Im Sonderfall des nichtkompetitiven Inhibitors<br />
wäre K i =K is. K m bliebe unverändert, aber V max würde nicht erreicht.<br />
B - Kompetitiv. Der Inhibitor bindet anstelle des Substrats. K m kann nicht erreicht werden während<br />
V max mit steigendem Substratüberschuss angenähert wird. K is hat keine Bedeutung, d.h. ist<br />
unrealistisch groß.<br />
C - Unkompetitiv. Der Inhibitor assoziiert nur, nachdem das Substrat bereits gebunden ist. V max kann<br />
nicht erreicht werden, währende der K m -Wert scheinbar sinkt (!). K i hat keine Bedeutung, d.h. ist<br />
unrealistisch groß.<br />
Reversible Hemmtypen werden häufig als kompetitiv, Mischtyp (ḿixed typé;<br />
Sonderfall: nichtkompetitiv) und unkompetitiv klassifiziert. Obgleich diese Typen<br />
häufig auf der Grundlage von Einsubstratenzymen definiert werden, sind sie - mit<br />
Ausnahme der kompetitiven Hemmung - nur für Mehrsubstratenzyme von<br />
Bedeutung.
77<br />
Km/Ki<br />
8.9.1 Die kompetitive Hemmung<br />
Neben der Substratüberschuss-Hemmung ist dies der gängigste Hemmtyp. Er<br />
begegnet uns in Form der Produkt-Hemmung (Hemmung der "Hinreaktion" durch<br />
das Reaktionsprodukt, welches zwangsläufig in Kompetition zum Substrat steht)<br />
sowie bei Substratanalogen. Substratanaloge wie das α-Ketobutyrat (8.10.2) können<br />
von einem Enzym (H 4 -Form der LDH) noch die Stelle eines Substrates einnehmen,<br />
während sie für ein Isoenzym (M 4 -Form der LDH) fast schon die Qualität eines<br />
kompetitiven Inhibitors haben. Um beim Beispiel der LDH zu bleiben: für beide<br />
Substrate, Pyruvat (Brenztraubensäure, "pyruvic acid") und NAD + gibt es strikte<br />
kompetitive Inhibitoren, nämlich Oxamat ("Oxamidsäure") bzw. Salicylat. ADP nimmt<br />
den Adenosinteil des Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD + -)<br />
Bindungsplatzes ein (Abb. 2.1). Einige strukturellen Ähnlichkeiten sind im<br />
folgenden hervorgehoben:<br />
Pyruvat Oxamat NAD + Salicylat<br />
(Nicotinamidteil)<br />
Substratanaloge Verbindungen können zur vorübergehenden (reversiblen)<br />
Hemmung von Enzymaktivitäten therapeutische Bedeutung haben. Beispiele sind<br />
Analoge des Acetylcholins zur Hemmung der lytischen Aktivität der Acetylcholinesterase,<br />
um vorübergehend höhere Konzentrationen des Neurotransmitters<br />
aufrechtzuerhalten.<br />
Eine rein kompetitive Hemmung zeichnet sich dadurch aus, dass der Vorgang<br />
für den die Inhibitionskonstante<br />
K i =<br />
[E][I]<br />
[EI]<br />
das Gleichgewicht bestimmt, mit der eigentlichen Reaktion<br />
E + S _ ><br />
ES<br />
_ ><br />
E+P<br />
konkurriert. Bei sehr großem Substratüberschuss kann somit das Substrat den
78<br />
Km/Ki<br />
Inhibitor faktisch verdrängen (was graphisch durch Extrapolation auf S -> 4 bzw 1/S-<br />
>0 erzielt wird) während bei mittleren Substratkonzentrationen ein verlangsamter<br />
Substratumsatz erfolgt.<br />
Von diagnostischem Wert für diesen Inhibitionstyp in seiner reinen Form sind<br />
somit die Tatsachen, dass<br />
- V max durch einen kompetitiven Inhibitor nicht beeinflusst wird, während<br />
- der K m -Wert scheinbar vergrößert wird (weshalb man hier zweckmäßig<br />
auch vom K m '-Wert spricht). Diese scheinbare Affinitätsveringerung ist<br />
eine Funktion der Inhibitorkonzentration und des K i -Wertes<br />
Dieser Sachverhalt wird fast durchweg durch das Lineweaver-Burk-Diagramm<br />
dargestellt. Eine lohnende Übung besteht darin, den gleichen Kompetitionstyp mit<br />
Hilfe der anderen unter 8.6 beschriebenen graphischen Verfahren zu<br />
charakterisieren - eine Fähigkeit, die dem<br />
Programm "MMenten" mitgegeben wurde.<br />
Abb. 8.9: Kompetitiver Inhibitionstyp, dargestellt<br />
nach Lineweaver-Burk. Beachte den konstanten<br />
1/V max Wert (infolge eines unveränderten V max ) und<br />
den von der Inhibitor- konzentration abhängigen<br />
Wert für -1/K m ' (infolge einer scheinbar<br />
verminderten Affinität)<br />
8.9.2 Die allosterische Hemmung<br />
Bei diesem Hemmtyp wird der Inhibitor (auch negativer Effektor/Regulator/Modulator<br />
genannt) im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung abseits vom aktiven Zentrum<br />
des Enzyms gebunden. Dabei kann eine Konformationsänderung ausgelöst werden,<br />
bei der Effektor- und Substrat-Bindungsplatz (d.h. aktives Zentrum) miteinander<br />
kommunizieren. Bei diesem Vorgang kann die Funktionsfähigkeit des aktiven<br />
Zentrums sinken (Erhöhung von K m ) oder die Zahl der aktiven Zentren erniedrigt<br />
werden (Erniedrigung von V max ). Ein klassisches Beispiel dieses Hemmtyps ist die<br />
sog. "feedback"-Inhibition, d.h. die Drosselung des ersten (oder eines frühen)<br />
Enzyms eines Stoffwechselweges durch dessen Endprodukt welches dann als<br />
negativer Effektor (nicht: Substrat) auf das erste Enzym einwirkt. Zur Vertiefung:<br />
siehe Kapitel 7.
79<br />
Km/Ki<br />
Die allosterische Hemmung wird häufig mit der nichtkompetitiven Hemmung gleichgesetzt – eine<br />
Vereinfachung, die selten gerechtfertigt ist. Als Sonderfall der allosterischen Hemmung ist die<br />
"negative Kooperativität" anzusehen. Sie wird bei oligomeren, aus gleichen Untereinheiten<br />
bestehenden Enzymen beobachtet, bei denen sich die Substratbindungsplätze gegenseitig<br />
behindern. Erstes Beispiel (1970) hierfür war die mit sinkender Affinität erfolgende Bindung von NAD +<br />
durch die tetramere GAPDH. cf. Conway und Koshland, Biochemistry 7, 4011 (1968).<br />
Zu allen allosterischen Hemmphänomenen gibt es die komplementären<br />
Aktivierungsmechanismen:<br />
negativer Effektor - positiver Effektor<br />
Inhibitor - Aktivator<br />
"feedback" Inhibition - "feed-forward" Aktivierung<br />
negative Kooperativität - positive Kooperativität<br />
(= Antikooperativität)<br />
Klassisches Beispiel einer positiven Kooperativität (d.h. mit steigender Affinität<br />
erfolgender Bindung) ist die Assoziation von O 2 oder CO 2 mit Hämoglobin, einem<br />
Carrierprotein. Inzwischen gibt es zahlreiche weitere Beispiele aus dem Bereich der<br />
Hormonrezeptoren und Enzyme (vergleiche PFK in Kapitel 7.1).<br />
Allosterische Inhibitoren gehören grundsätzlich dem ḿixed typé an. Ist K i<br />
(relativ zu K is ) sehr groß, so spricht man auch vom "unkompetitiven" Typ. Wäre<br />
K i =K is (was unwahrscheinlich ist), so läge der Fall eines nichtkompetitiven Inhibitors<br />
vor<br />
Abb. 8.10: Allosterische Beeinflussung der Substrat<br />
(S) Bindung durch einen Modulator (M) infolge einer<br />
(allosterischen) Konformationsänderung.<br />
8.9.3 Die "nicht-kompetitive" (allgemeiner: " mixed-type" Hemmung)<br />
Leider wird dieser Hemmtyp zumeist mit der allosterischen Hemmung verwechselt.<br />
Er wäre jedoch nur im Grenzfall mit diesem Hemmtyp identisch, nämlich dann, wenn<br />
Bindung des Modulators (M) den Substratumsatz (nicht notwendigerweise die<br />
Substratbindung) in irreversibler Art und Weise ausschließen würde. Die Literatur<br />
liefert hierfür nicht ein einziges sauberes Beispiel, obgleich der Einfluss von Phe auf<br />
Pyruvatkinase dem nahekommen soll.<br />
Gekoppelt mit dem Begriff des nicht-kompetitiven Inhibitors ist das Postulat,<br />
dass V max auch bei beliebigem Substratüberschuss nicht erreicht werden kann. K m<br />
bliebe jedoch identisch, da eine Coexistenz von inhibierten (d.h. enzymkinetisch<br />
nicht sichtbaren) und nicht inhibierten (d.h. normalen) Enzymmolekülen vorliegt.<br />
Originellerweise werden diese Kriterien gerade durch "Enzymgifte" erfüllt, die eine<br />
zum aktiven Zentrum gehörende katalytische Aminosäureseitenkette blockieren
80<br />
Km/Ki<br />
(vergl. Kap. 9). Diese genügen jedoch nicht der bei der ursprünglichen Formulierung<br />
dieses Hemmtyps geforderten Reversibilität des Hemmvorganges.<br />
Strikt genommen kommen einem "mixed-type" Inhibitor zwei Inhibitionskonstanten zu. Konstante K i<br />
gilt für seine Bindung an das nackte Enzym, K is für die Bindung an den Enzym-Substratkomplex. Die<br />
allgemeine, aus der Michaelis-Menten Beziehung abgeleitete Inhibitionsgleichung<br />
v = __________V max × [S]____________<br />
K m (1 + [I]/K i ) + [S](1 + [I]/K is )<br />
gilt für "mixed-type" Inhibitoren in der gezeigten, vollständigen Form, für nichtkompetitive Inhibitoren<br />
ist sie erfüllt, wenn Ki = Kis (d.h. in einem kaum zutreffenden Sonderfall, dem in Lehrbüchern<br />
ungebührender Raum gegeben wird). Im Falle eines kompetitiven Inhibitors vereinfacht sich die<br />
Gleichung durch Fortfall des Terms 1+[I]/K is und im Falle des unkompetitiven Inhibitors durch Fortfall<br />
von 1+[I]/K i . Ein hervorragendes Kriterium für die Beurteilung des Inhibitionstyps liefert das Programm<br />
"Composit", Option "[I]nhibition/[R]eversibel", bei dem K is im kompetitiven Fall gegenüber K i<br />
außerordentlich große Werte annimmt (somit den Term [I]/K is gegen Null gehen läßt). Im Vorgriff auf<br />
Kapitel 8.8.4 ist anzumerken, dass dort durch große K i -Werte der Term [I]/K i gegen Null ginge.<br />
Als klassisches Kriterium des Hemmtyps ist nachfolgend wieder das Lineweaver-<br />
Burk Diagramm angeführt:<br />
Abb. 8.11: sog. "nicht-kompetitive" Hemmung,<br />
dargestellt im Lineweaver-Burk Diagramm<br />
8.9.4 Die "un-kompetitive" Hemmung<br />
Neben der kompetitiven und der nicht-kompetitiven Hemmung gibt es noch einen<br />
dritten einfachen Hemmtyp, die unkompetitive Hemmung, welche bei Einsubstrat-<br />
Enzymen selten, bei Mehrsubstratenzymen häufiger auftritt.<br />
Ein Inhibitor, der nur an den Enzym-Substrat-Komplex und nicht an das freie<br />
Enzym bindet, wird als "unkompetitiv" bezeichnet. Die Reihenfolge der Bindung ist<br />
festgelegt ("obligatory-order"), d.h. I kann nur nach S binden. Folgendes Schema<br />
zeigt diesen Sachverhalt mit k 1 , k -1 , k 2 , Geschwindigkeitskonstanten und K is ,<br />
Dissoziationskonstante des ESI-Komplexes:
81<br />
Km/Ki<br />
Demnach wird der Inhibitor V max (k 2 ) erniedrigen, denn ein Teil des Enzym-Substrat<br />
Komplexes wird ständig in Richtung des inaktiven Komplexes ESI gelenkt. Ferner<br />
wird die Geschwindigkeitskonstante k 1 durch Anwesenheit des unkompetitiven<br />
Inhibitors I erhöht, da für die Wandlung des ES-Komplexes ein alternativer Weg (zu<br />
ESI) eröffnet wird. Da k 1 Bestandteil der Dissoziationskonstanten des ES-Komplexes<br />
(K d =k- 1 /k 1 ) bzw. seines K m Wertes ((k- 1 +k 2 )/k 1 ) ist, wird somit der K m -Wert scheinbar<br />
erniedrigt, die Affinität des Substrates zum Enzym scheinbar erhöht. Im Lineweaver-<br />
Burk Diagramm sind sowohl 1/V max als auch -1/K m gegenüber der nichtinhibierten<br />
Reaktion mit (1+[I]/K is ) zu multiplizieren, so dass sich Parallelen ergeben (siehe<br />
Abbildung). 25 . Zusammengefasst: Im Gegensatz zum nichtkompetitiven Inhibitor<br />
erfolgt die Assoziation eines unkompetitiven Inhibitors nicht unabhängig vom<br />
Substrat. Die Substrat-abhängige Bildung des ESI-Komplexes bedingt eine<br />
scheinbare Erniedrigung von K m und<br />
V max .<br />
Abb. 8.12: Unkompetitiver Hemmtyp,<br />
dargestellt im Lineweaver-Burk Diagramm<br />
25 dies ergibt sich aus der Tatsache, dass hier die wie folgt modifizierte Inhibitionsgleichung anzusetzen ist:<br />
v = __V max × [S]______<br />
K m + [S](1 + [I]/K is )<br />
die in der Umformung nach Lineweaver-Burk wie folgt lautet:<br />
1 = K m . 1 + 1+I/K is<br />
v V max S V max<br />
Damit ergibt sich für 1/S = 0 das 'y-intercept' zu 1/v = (1+I/K is )/V max und für 1/v = 0 das 'x-intercept' zu<br />
1/S = - (1+I/K is )/K m
82<br />
Km/Ki<br />
8.9.5 Nomenklaturvorschläge und Definitionen zum Gebiet der Enzymhemmung<br />
und -regulation 26<br />
1) Inhibitoren vom K m-Typ (klassische kompetitive Inhibitoren)<br />
1.1 Besetzen Substrat-Bindungsplatz,<br />
1.2 sind Substratanaloge (Reaktionsprodukte, transition-state Analoge, o.ä.),<br />
1.3 senken scheinbar die Affinität für das Substrat (K m steigt),<br />
1.4 V max wird bei Substratüberschuss erreicht.<br />
2) Inhibitoren vom V max-Typ (klassische nichtkompetitive Inhibitoren und Enzymgifte)<br />
2.1 Binden allosterisch (nichtkomp. Inh.) oder<br />
2.2 binden irreversibel an Substratbindungsplatz (Enzymgifte)<br />
2.3 in keinem Fall wird V max bei Substratüberschuss erreicht<br />
2.4 sind keine Substratanaloge (Ausnahme: Affinitätsmarkierung!)<br />
3) Allosterische Effektoren (K m - oder V max -Typ)<br />
3.1 Besetzen allosterischen Bindungsplatz (vergleichbar 2.1),<br />
3.2 erfüllen nicht unbedingt Kriterium 2.3, d.h.:<br />
3.3 Effektorbindung beeinflusst Substratbindung, aber nicht umgekehrt: V-Typ (enzymkinetisch<br />
nicht unterscheidbar von 2)), bzw.<br />
3.4 Effektorbindung beeinflusst Substratbindung und umgekehrt: K m -Typ (enzymkinetisch<br />
nicht unterscheidbar, jedoch mechanistisch verschieden von 1)).<br />
3.5 Neben Inhibitoren umfaßt diese Gruppe auch Aktivatoren<br />
8.9.6 Bestimmung von K i und K is aus sekundären Plots<br />
Als diagnostisches Werkzeug zur Beschreibung von Inhibitionstypen kommt dem<br />
Lineweaver-Burk Diagramm nach wie vor die größte Bedeutung zu. Zur Ermittlung<br />
von K i -Werten erscheint seine direkte Anwendung umständlich, da K i aus einer<br />
Reihe von Achsenabschnitten gemittelt werden muss. Eine klassische Lösung dieses<br />
Problems besteht in der Anfertigung sekundärer 'plots', in denen<br />
- die Steigungen der Geraden aus dem Lineweaver-Burk Diagramm (Ordinate) als<br />
Funktion der jeweiligen Inhibitorkonzentration (Abszisse) aufgetragen werden. Der<br />
neue Abszissenschnittpunkt ergibt dann direkt K i (nicht durchführbar im Falle eines<br />
unkompetitiven Inhibitors, bei dem nur K is realisiert ist).<br />
- die 'intercepts' (d.h. die Lineweaver-Ordinatenabschnitte = neue Ordinatenwerte) als<br />
Funktion der jeweiligen Inhibitorkonzentrationen (Abszisse) aufgetragen werden.<br />
Diese Auftragung, möglich im Falle des "mixed-type", des nichtkompetitiven und des<br />
unkompetitiven Inhibitors, erlaubt am Abszissenschnittpunkt die Ablesung des K is<br />
Wertes. 27<br />
Derartigen sekundären "plots" sollten, wenn möglich, "bereinigte" Lineweaver-Burk<br />
Diagramme zugrunde liegen. Zur Herstellung dieser Diagramme verwendet man die<br />
nach einem verlässlicheren Verfahren (direkt-linearer "plot" oder computergestützte<br />
nichlineare Regression) ermittelten Werte für K m und V max . Der gesamte Vorgang<br />
kann mit Hilfe des Programmes "MMenten" (Optionen [I]nhibition, [R]eversible)<br />
demonstriert bzw. ausgeführt werden.<br />
26 Diese Aufstellung unterscheidet nur in V max - und K m -Typ, umfasst daher nicht die sog. 'mixed-type'<br />
und 'unkompetitiven Inhibitoren', die beides beeinflussen.<br />
27 Abb. 8.11: Inhibitionsmuster und deren Analyse in sekundären ṕlotś (die zwei nächsten Seiten)
83<br />
Km/Ki
84<br />
Km/Ki
85<br />
Km/Ki<br />
9.7 Dixon-Auftragung zur direkten Ablesung von K i -Werten<br />
Literatur: M. Dixon und E.C. Webb "Enzymes", Academic Press 1964, pp 328<br />
Der nachfolgend vorgestellte "Dixon-Plot" erlaubt eine graphische Mittelwertsbildung<br />
von Schnittpunkten aus verschiedenen Messreihen; K i ist durch den<br />
mittleren Abszissenwert dieser Punkte definiert während Kis auf diesem<br />
Wege grundsätzlich nicht ermittelt werden kann. 28<br />
Man bestimmt die Geschwindigkeit bei verschiedenen Substrat- und Inhibitorkonzentrationen.<br />
Im Diagramm von 1/v vs. I erhält man dann Geraden, die sich<br />
bei - K i schneiden (Abb. a) und b)).<br />
Falls ein V max -Wert für die Reaktion bereits bestimmt wurde, ist es im kompetitiven Fall nur nötig,<br />
Messungen bei einer Substratkonzentration durchzuführen, denn der Punkt, der K i definiert liegt dann<br />
auf der Höhe 1/V max (Abb. c).<br />
Abb. 8.12: Graphische Bestimmung von Inhibitionskonstanten nach Dixon ("Dixon Plot")<br />
Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass Dixon später einen erweiterten Plot entwickelt hat, der<br />
einige fragliche Annahmen eliminiert (Biochem. J. 129, 197, 1972): "The principle of Dixon (1965) has<br />
been extended to give rapid graphical methods for determining ... K m and K i . It does away with the sometimes<br />
questionable assumption that the amounts of substrate or inhibitor bound by the enzyme are negligible in<br />
comparison with the total amount added, and is therefore valid even for cases of high affinity where the usual<br />
methods fail. Besides doing away with the need for calculation, it enables the concentrations of the various<br />
components of the system to be read off directly for any point of the velocity curve."<br />
Das Programm Composit bietet unter der Option [I]nhibitors, [C]oncentration [E o ] =<br />
[I o ] eine andere Lösung dieser Problematik und stellt den "Easson-Stedman-plot"<br />
vor. 29<br />
28 Da der Dixon plot die weiteste Verbreitung gefunden hat, haben wir seine Beschreibung im Skript<br />
belassen; eine Demonstration seiner Eigenschaften und Grenzen ist Teil des MMenten-Programms<br />
unter den Optionen [I]nhibitors, [R]eversible. Ansonsten empfehlen wir ihn für Praktikumszwecke nicht<br />
mehr.<br />
29 L. H. Easson & E. Stedman (1936), Proc. Roy. Soc. B 121, 141-164; J. Bieth (1984), Biochem.<br />
Med. 32 387-397. Die Situation [E o ] = ca. [I] ist typisch für das System aus Protease und -Inhibitor,<br />
welches nicht auf klassischem Wege behandelt werden kann.
86<br />
Km/Ki<br />
8.10 Versuch E1: Der Km-Wert der LDH-Pyruvat Reaktion; Inhibition durch<br />
NAD + , ADP, Salicylat oder Oxamat<br />
Substanzen: 1) Puffer<br />
30 mM Na-Phosphat, pH 7.4<br />
2) 20 mM Na-Pyruvat in (1)<br />
3) 4.8 mM NADH,H + in (1)<br />
4) 50 mM NAD + in (1) (pH-Kontrolle!!!! Ggf. auf 7.4 stellen!) 30<br />
5a) 75 mM Na-Salicylat (wie (4))<br />
5b) 3 mM Na-Oxamat (wie (4))<br />
5c) 50 mM ADP (wie (4))<br />
6) LDH, 1-5 µl Kristallsuspension in 1 ml (1). Enzym aus Skelettoder<br />
Herzmuskel (s. Fußnote)<br />
Man versetze 2.7-2.79 ml des Puffers (1) mit 100 µl LDH (6) und Inhibitor (wo<br />
zutreffend). Für diese Mischung stellt man das Photometer auf E = 0. Nach Zusatz<br />
von 100 µl NADH,H + (3) kann die E 340 für den Reaktionsbeginn ermittelt werden. Man<br />
starte die Reaktion durch Zugabe von 100, 50, 30, 20 bzw. 10 µl Pyruvat (2) und<br />
registriere den Abfall der E 340 . Gesamtvolumen für alle Ansätze: 3.0 ml.<br />
Entsprechende Versuchsreihen führe man in Gegenwart von 100, 250 und<br />
500 µl (4) bzw. (5) durch und übertägt die gesammelten Daten in ein Lineweaver-<br />
Burk-Diagramm der Form:<br />
- welchen K m -Wert hat Pyruvat<br />
mit dem reinen Kaninchenmuskel-<br />
Enzym?<br />
- hemmen NAD + (Salicylat,<br />
Oxamat, Adenosinphosphate) die<br />
Reaktion kompetitiv, nicht-kompetitiv<br />
oder unkompetitiv? Zur Interpretation<br />
bitte Sonderkapitel 8.13.1 beachten!<br />
- erklären Sie den Befund, dass<br />
Salicylat bzw. Oxamat die Substratbindungsplätze<br />
einnehmen können<br />
- Ist der Schritt 12 des Glycolyseschemas somit sehr anfällig gegen<br />
Produkthemmung (NAD + ) bzw. ist er hemmbar durch Substrat/Produktanaloge?<br />
Aus sekundären Plots der Steigung gegen die Inhibitorkonzentration bzw. der y-<br />
30 die NAD + - Hemmung zeigt sich am besten bei Verwendung des Herzmuskelenzyms. Grund?
87<br />
Km/Ki<br />
Achsenabschnitte gegen die Inhibitorkonzentration werden die K i - bzw. K is -Werte<br />
ablesbar, ein Verfahren das in MMenten demonstriert und vollzogen werden kann.<br />
Mit gleichem oder besserem Erfolg lassen sich beide Konstanten auch in Composit<br />
durch nichtlineare Regression direkt ermitteln. Bitte zur Dateneingabe immer die<br />
Anweisungen aus Kap. 8.1 (Fußnote) beachten. Zuerst Datensatz für die Messreihe<br />
ohne Inhibitor, dann diejenigen für die geringste Inhibitorkonzentration eingeben etc..<br />
Im Zweifelsfall Beispiel-'files' inspizieren (C:\EN\IX*.*).<br />
- Welche K i - und K is Werte haben NAD + , Salicylat, bzw. Adenosinphosphate?<br />
31 Welches Inhibitionsmuster leiten Sie aus der Relation<br />
dieser Werte her? Entsprechen die Schlussfolgerungen jenen aus den<br />
vorstehenden Verfahren?<br />
- Versuch E4: unter IX30 - IX46 wurden prototypische Inhibitions-files<br />
abgespeichert. Jede Gruppe sollte im Rahmen dieser Versuchgruppe<br />
zwei dieser ´files´ auswerten.<br />
31 Bitte beachten Sie, dass K is -Werte nicht aus dem Dixon-Diagramm zu entnehmen sind. Für eine<br />
vollständige Analyse sind durch direkt-lineare Auftragung 'bereinigte' Lineweaver-Burk Plots<br />
anzufertigen (vergl. Kap. 8.8.6). Alternativ kann die gesamte Messreihe durch die Option [L]ink in<br />
Makafil zu einem 'composite file' zusammengefaßt und in Composit optimiert werden (Optionen<br />
[I]nhibition [R]eversible). Die so optimierte Messreihe erzeugt im Lineweaver-Burk Diagramm<br />
zwangsläufig einen gemeinsamen Schnittpunkt (Ausnahme: Parallelen bei unkompetitiver Inhibition).<br />
Graphische Darstellungen nach Lineweaver-Burk und für jedes Linearisierungsverfahren übernimmt<br />
auch das Programm MMenten.
88<br />
Km/Ki<br />
Optische Tests für diese Krankheitsmarker werden im ersten Dienstagsseminar besprochen. Eine<br />
empfohlene Übung besteht darin, das Prinzip und die Zusammensetzung der auf dem Markt<br />
befindlichen Testkits anhand folgender Internetseite(n) nachzuvollziehen (fettgedruckte Rubriken):<br />
http://www.merckeurolab.de/; Themengebiete; Klinische Chemie<br />
Klinische Biochemie (Internet-Beispiel)<br />
Die Klinische Chemie hat bei Merck eine sehr lange Tradition und basiert auf einer<br />
großen, jahrzehntelangen Erfahrung.<br />
Unseren Kunden im medizinischen Labor stellen wir weltweit für alle<br />
diagnostischen Fragestellungen auf allen Indikationsgebieten ein umfassendes<br />
Parameterspektrum zur Verfügung.<br />
Alle unsere Produkte sind gekennzeichnet durch einen hohen und<br />
gleichbleibenden Qualtätsstandard in Produktion und Qualitätskontrolle.<br />
Moderne Methoden, basierend auf der internationalen Standardisierung,<br />
wahlweise Temperaturführung bei 25, 30 oder 37C, große<br />
Anwenderfreundlichkeit und Packungskonzepte für den hohen und niedrigen<br />
Durchsatz mit den entsprechenden<br />
Applikationen auf den Analysern von heute und morgen sind weitere Pluspunkte<br />
unserer Reagenzlinien in der Klinischen Chemie. Wir haben den Test für jeden<br />
gewünschten Parameter.<br />
1. Diabetesdiagnostik<br />
2. Herzdiagnostik<br />
3. Leberdiagnostik<br />
4. Nierendiagnostik<br />
5. Fettstoffwechseldiagnostik<br />
6. Pankreasdiagnostik<br />
7. Elektrolyte<br />
8. Andere Reagenzien<br />
9. Kontrollsera<br />
10. Entzündungsparameter
89<br />
Km/Ki<br />
8.11 Isoenzyme der Lactat-dehydrogenase; Bedeutung in der klinischen<br />
Biochemie (H 4 = Typ 1, M 4 = Typ 5)<br />
Für die Diagnostik des Herzinfarktes sowie<br />
anderer organischer Krankheiten hat die<br />
Charakterisierung des überwiegenden LDH-<br />
Isoenzyms im Serum besondere Bedeutung<br />
erlangt. Die elektrophoretische Charakterisierung<br />
(siehe Abb. links) ist am präzisesten,<br />
jedoch auch am aufwendigsten,<br />
da zuvor Fremdproteine abgetrennt werden<br />
müssen. Schnelltests beruhen daher auf<br />
unterschiedlichen thermischen Stabilitäten,<br />
unterschiedlichen K m -Werten und unterschiedlichen<br />
Spezifitäten (vergl. auch die<br />
Daten in Kapitel 3.5). Die beiden letzteren<br />
Parameter sollen in den Versuchen E2<br />
herangezogen werden, um die Isoenzyme<br />
in verschiedenen Geweben näher zu<br />
charakterisieren.<br />
Abb. 8.13: LDH-Isoenzymmuster bei<br />
verschiedenen Krankheitsbildern<br />
Weitere Schlüsselenzyme für die Diagnose von Gewebeläsionen sind:<br />
- Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH); vergl. Versuch E2.1<br />
- Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)<br />
- Glutamat-Oxalacetat-Dehydrogenase (GOT); auch: Aspartat-Aminotransferase<br />
(ASAT)<br />
- Glutamat-Pyruvat Dehydrogenase (GPT); auch: Alanin-Amionotransferase<br />
(ALAT)<br />
- Creatin-phosphokinase (CPK); auch: Creatinkinase (CK)
90<br />
Km/Ki<br />
8.11.1 Versuch E2.1: "Hydroxybutyrat-Dehydrogenase"-Aktivität der LDH-<br />
Isoenzyme in Herz und Leber 32<br />
α-Ketobutyrat<br />
Pyruvat-Analogon<br />
α-Hydroxybutyrat<br />
Lactat-Analogon<br />
LDH vom Muskeltyp (M 4 ) diskriminiert wesentlich stärker zwischen ihren wahren<br />
Substraten (Pyruvat und Lactat) und den Homologen Ketobutyrat und Hydroxybutyrat<br />
als das Herzenzym. Ein schneller klinischer Test auf Herzinfarkt beruht daher auf der<br />
"Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Aktivität" im Serum. Im Standardtest liegt der<br />
Quotient der Aktivitäten, HBDH/LDH beim Menschen im Herzmuskel bei 1 (keine<br />
Unterscheidung der Substrate), in den Erythrozyten bei 0.9, im Lebergewebe und der<br />
Skelettmuskulatur zwischen 0.3 und 0.4. Im Normalserum schwankt HBDH/LDH<br />
zwischen 0.62 und 0.82, nach einem Infarkt liegt er deutlich darüber.<br />
Aufgabe: Bestimmen Sie den HBDH/LDH-Quotienten für die Enzyme in obigen<br />
Extrakten. Hierzu benötigen Sie die Substanzen aus Versuch A1 sowie eine 50 mM<br />
Lösung von Na-Ketobutyrat. Sodann bestimmen Sie die Umsatzgeschwindigkeiten<br />
mit jedem der Substrate. Bitte ermitteln Sie, ob es sich bei den Messwerten um<br />
wahre Aktivitäten (d.h. Messung bei Substratsättigung) handelt, oder ob die<br />
verschiedenen Quotienten Affinitätsunterschiede reflektieren.<br />
32 Achtung: die untersuchten Extrakte sind bitte für die an anderer Stelle vorzunehmenden K m -Wert<br />
Bestimmungen aufzubewahren!!
91<br />
Km/Ki<br />
8.11.2 Versuch E2.2: Km-Werte der LDH- Isoenzyme<br />
Aus Versuch E.2.1 besitzen Sie Extrakte aus verschiedenen Organen, für welche Sie<br />
den HBDH/LDH-Quotienten bestimmt haben. Wählen Sie einen Extrakt aus, der<br />
durch sein HBDH/LDH-Verhältnis (0.5-0.8) erkennen lässt, dass er Anteile beider<br />
Isoenzyme (H und M) enthält; dies sollte im Skelettmuskelextrakt gegeben sein.<br />
Diesen Extrakt sollten Sie zunächst so weit im Puffer aus Versuch E1 verdünnen,<br />
dass die Aktivitäten bei Sättigung gut messbar sind. Sodann bestimmen Sie die K m -<br />
Werte nach der in E1 gegebenen Vorschrift mit den Lösungen1-3 (keine inhibitoren!).<br />
Da für das H 4 -Enzym (HBDH/LDH nahe 1) niedrigere K m -Werte zu erwarten sind<br />
(Kap. 3.5) als für das Muskelenzym, sollte ein weiter Bereich an Pyruvat-Konzentrationen<br />
(10 -4 bis 10×10 -3 M, d.h. 0.1-10 mM) untersucht werden. Da ferner das<br />
H4 Enzym in Gegenwart von Pyruvat und NAD + das Phänomen einer Substrat- bzw.<br />
einer "Substrat/Produkthemmung" zeigen kann, sind die Messungen bei höheren<br />
Pyruvatkonzentrationen entsprechend zu werten. Jede Sättigungskurve ist durch<br />
mindestens zehn Messpunkte in der Region der K m -Werte zu belegen.<br />
- Welches sind die K m -Werte der Lactatdehydrogenase(n)?<br />
- Ergibt die Angleichung der Messpunkte im direkt-linearen Plot das Bild einer idealen<br />
Hyperbel?<br />
- Führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse mit Hilfe von "Composit" durch.<br />
Erhalten Sie einen besseren "fit" bei Verwendung der Option [D]ouble hyperbolic<br />
anstelle von [H]yperbolic? 33 .<br />
Sollte [D]ouble hyperbolic zwei Hyperbeln gleichen Km-Werts ermitteln, ist eine<br />
gleichwertige Annäherung auch durch [H]yperbolic möglich. Warum?<br />
- Sie haben den Scatchard-Plot als probates Mittel zur Diagnose nichthyperbolen<br />
Verhaltens kennengelernt<br />
- führen Sie in Composit die Angleichung unter [D]ouble-hyperbolic durch;<br />
- bestätigen Sie die Option śave fitted data on disḱ mit [P]roceed und speichern Sie die<br />
angeglichene Datenreihe (wie voreingestellt) unter ÉX́ ab;<br />
- springen Sie in das Programm MMenten [S]ubstrate concentration / read a [F]ile<br />
- rufen Sie (wie voreingestellt) ÉX́ auf; drücken Sie bis zum Graphik-Menu<br />
- wählen Sie [Sc] und drücken Sie dann bis zum Erscheinen des Scatchard<br />
Diagramms; handelt es sich um eine Gerade oder ist eine systematische Abweichung<br />
zu erkennen?<br />
- Sollte die Option [H]yperbolic eine optimale Angleichung ergeben: verwenden Sie ein<br />
Gemisch (1:1 hinsichtlich der Aktivitäten) aus Leber- (M4) und Herzmuskel-Extrakt<br />
(überwiegend H 4 ).<br />
33 Die Option [H]yperbolic ist die Angleichung an die gewöhnliche Michaelis-Menten Gleichung<br />
v=(V max . S)/(K m +S); die Option [D]ouble hyperbolic erledigt die Angleichung an eine doppelte Michaelis-<br />
Menten Gleichung, i.e. v={(V max (1) . S)/(K m (1)+S)} + (V max (2) . S)/(K m (2)+S)}. Literatur: R. G. Duggleby<br />
(1988), J. Theor. Biol.130, 123-124; die dort beschriebene Routine wurde als Option [D]ouble<br />
hyperbolic implementiert
92<br />
Km/Ki<br />
V max<br />
K2 m K1 m<br />
V2 max<br />
V1 max<br />
Abb. 8.14: Zusammengesetzte Hyperbel.<br />
Gezeigt ist die Kooperation zweier Isoenzyme mit K(1) = 1,<br />
V(1) = 20 und K(2) = 100, V(2) =100 (File DEMO.ISO) und<br />
der Versuch ihrer Analyse im direkt-linearen Diagramm.<br />
Untersuchen Sie durch Computeranalyse, ob diese<br />
Hyperbel auch durch andere Kombinationen von K m und<br />
V max angeglichen werden kann (nach: Praktikum BB3<br />
1998).<br />
[Pyruvat]<br />
Abb. 8.15: Zusammengesetzte Hyperbel<br />
(Praktikumsbeispiel aus BB3 1999. Angleichung über<br />
Composit ergibt die folgenden Parameter:<br />
V(1) = 0.3<br />
K(1) = 0.04<br />
V(2) = 0.4<br />
K(2)=1.5
93<br />
Tricks<br />
8.12 Versuch E3: Der Km-Wert der Alkoholdehydrogenase-Ethanol-Reaktion<br />
Literatur: J. Pharm. Pharmacol. 19, 355, 1967<br />
Substanzen:<br />
1) Puffer: 67 mM Glycin (pH 10 mit NaOH)<br />
2) 36 mM Ethanol (166 mg = 210 µl Ethanol ad 100 ml mit (1))<br />
3) 50 mM NAD + (aus Versuch E1)<br />
4a) 75 mM Na-Salicylat in (1) (pH-Kontrolle!)<br />
4b) 20 mM AMP oder ADP in (1) ( " )<br />
5) Alkoholdehydrogenase (ADH aus Pferdeleber); 1-10 µl<br />
Kristallsuspension in 1 ml (1) (ausprobieren!!)<br />
Man versetze 2.8 -2.7 ml Puffer (1) mit 0 34 , 10, 20, 30, 50 bzw. 100 µl an Ethanol (2)<br />
sowie 100 µl an NAD + (3). Das Photometer wird auf E 340 =0 geeicht und die Reaktion<br />
durch Zugabe von 100 µl ADH (5) gestartet. Man registriert den Anstieg der E 340 .<br />
Gesamtvolumen für alle Ansätze: 3.0 ml.<br />
Entsprechende Versuchsreihen führe man in Gegenwart von 50, 100 und 200<br />
µl Inhibitor (4a bzw. 4b) durch und überträgt die gesammelten Daten in ein<br />
Lineweaver-Burk Diagramm:<br />
- welchen K m -Wert hat Ethanol mit ADH?<br />
- welches Inhibitionsmuster ergibt Salicylat (bzw. AMP/ADP)?<br />
- Wie wäre dies bei der komplementären Versuchsanordnung (konstante<br />
Konzentration an EtOH, steigende Konzentrationen an NAD + )?<br />
- welchen K i - bzw. K is -Wert hat Salicylat (AMP/ADP) in der ADH Reaktion?<br />
Bitte den vollständigen Fragen- und Aufgabenkatalog unter E1<br />
beachten.<br />
34 Einige ADH-Präparationen werden mit Ethanol stabilisiert geliefert. In diesem Fall (überprüfen!) ist<br />
eine Reaktion bereits ohne externe EtOH-Zugabe zu registrieren. Schätzen Sie die<br />
Basiskonzentration an EtOH entweder in einem Kontrollansatz nach vollständiger Umsetzung oder<br />
durch Ermittlung der EtOH-Zugabemenge, bei der sich die Anfangsgeschwindigkeit verdoppelt.<br />
Berücksichtigen Sie d iese bei Ihren Kalkulationen.
94<br />
Tricks<br />
8.13 Versuch E4: Berechnung von Inhibitionskonstanten aus optimierten<br />
Datenreihen<br />
Unter C\EN sind auf der Festplatte Datenreihen mit den Nummern IX31-IXnm zu<br />
Demonstrations bzw. Übungszwecken abgespeichert. Jede Gruppe sollte einen<br />
(oder mehrere) dieser 'files' auswerten, z.B. Gruppe 1 die Datenreihe IX31, Gruppe 2<br />
IX32 etc..<br />
8.14 BESONDERHEITEN BEI MEHRSUBSTRATREAKTIONEN<br />
Bisswanger (1994) "Enzymkinetik", pp 138; Voet und Voet (1992) "Biochemie", pp342;<br />
http://de.wikipedia.com/Mehrsubstratreaktion<br />
Die Michaelis-Menten Beziehung und einige ihrer Erweiterungen bezogen sich<br />
ursprünglich nur auf Einsubstrat-Umsetzungen. In der Realität arbeiten typische<br />
Enzyme mit zwei oder mehreren Co-Substraten (LDH mit NADH,H + und Pyruvat).<br />
Die Formalismen in ihrer einfachen Form erweisen sich auch für diese Erweiterung<br />
solange als gültig, wie man die Konzentrationsabhängigkeit nur eines Substrates<br />
untersucht und die anderer Substrate in sättigenden Mengen vorlegt. Damit erhält<br />
man die kinetischen Konstanten des variierten Substrats, nicht jedoch Informationen<br />
über den Mehrsubstrat-Mechanismus (welche eine gegenseitige Variation aller<br />
beteiligten Substrate erfordert).<br />
Eine eingehende Beschreibung von Mehrsubstrat-Reaktionen geht auf W.<br />
Wallace Cleland (1963) zurück.<br />
In der Nomenklatur nach Cleland bezeichnet man Substrate in der Reihenfolge ihrer Bindung mit<br />
A,B,C, die Produkte in der Reihenfolge ihrer Ablösung als P,Q,R. Das Enzym bildet mit Substraten<br />
bzw. Produkten 'transitory complexes' der Form EA, EP, etc. Die Zahl der Substrate, die insgesamt<br />
an der Hinreaktion und die der Produkte, die an der Rückreaktion teilnehmen, wird durch uni-/bi-/teretc.<br />
benannt. LDH würde somit einem 'sequential-bi-bi' Mechanismus folgen, während<br />
Transaminasen bzw. FAD-abhängige Dehydrogenasen (deren Coenzym durch ein Folgesubstrat zu<br />
regenerieren ist) einem 'ping-pong-bi-bi' Mechanismus gehorchen.<br />
Führt man enzymkinetische Messreihen, jeweils in Gegenwart einer<br />
nichtsättigenden, aber konstanten Konzentration von A (NADH,H + ), bei steigenden<br />
Konzentrationen von B (Pyruvat) durch, so entsteht im Lineweaver-Burk Diagramm<br />
das Muster einer ḿixed typé Inhibition (Abb.8.14 zeigt den Idealfall eines<br />
nichtkompetitiven Musters). Auswertung der Primärbindungsdaten (hier: drei<br />
Hyperbeln) durch nichtlineare Regression kann im Programm DNRPeasy durch<br />
Anpassung an die erweiterte Michaelis-Menten Gleichung für<br />
Zweisubstratreaktionen vorgenommen Werten:<br />
v =<br />
Vmax[ A][ B]<br />
K K + K [ B] + [ A][ B]<br />
iA mB mA<br />
Daraus resultieren K m Werte für beide Substrate, sowie ein Wert "K iA".. K iA<br />
kennzeichnet die Bindung des Substrates A an das freie Enzym, d.h. für die Bildung<br />
eines katalytisch noch nicht aktiven Übergangskomplexes; der Wert ist identisch mit<br />
der Inhibitionskonstanten, die A als Produktinhibitor bei der Rückreaktion hätte.<br />
Analoge Informationen entnahm man früher Sekundärauftragungen der ślopeś bzw.<br />
ínterceptś des Lineweaver-Burk Diagramms (Abb. 8.14) und handelte sich damit alle<br />
Nachteile dieses Verfahrens ein (Abb. 8.5.).
95<br />
Tricks<br />
Abb. 8.14; A: Substratumsatz von Pyruvat durch LDH bei drei nicht-sättigenden Konzentrationen von<br />
NADH,H + (A 3 >A 2 >A 1 ). Im Lineweaver-Burk Diagramm entsteht scheinbar das Muster einer<br />
nichtkompetitiven Inhibition. Schnittpunkt der Linienlinks der 1/v Achse ist typisch für einen<br />
sequenziellen Mechanismus (8.14.1; beim Ping-Pong Mechanismus (8.14.2) entstände, analog der<br />
unkompetitiven Inhibition, eine Schar paralleler Geraden [Voet & Voet, S. 364]). B; sekundärer Plot<br />
der ínterceptsáus Teil A zur Bestimmung des K m -Wertes für das zweite Substrat (NADH,H + ); im<br />
Gegensatz zu den Sekundärdiagrammen der Hemm-Mechanismen, wo direkt gegen [I] aufgetragen<br />
wird (Abb. 8.11) ist hier die Steigung genen 1/[B] aufzutragen.<br />
(Bisswanger "Enzymkinetik 1979, S. 118; Zeichnung nach Tabelle 2.1 in: Bisswanger „Enzymkinetik“<br />
(1994), p137<br />
8.14.1 Sequenzieller Mechanismus: geordnet oder willkürlich<br />
W. W. Cleland, Biochim.Biophys.Acta 67, 104-137 (1963); Meth. Enzymol. 63, 1-65 (1975).<br />
Nur der sequenzielle bi-bi Mechanismus, nicht aber uni-bi- oder uni-uni<br />
Reaktionen weisen Aspekte der nichtkompetitiven Hemmung auf. Das in Abb. 8.14<br />
gezeigte Muster des Lineweaver-Burk Diagramms gilt unabhängig davon, ob die<br />
Substrate/Produkte in einer obligatorisch festgelegten, „geordneten“ Reihenfolge<br />
gebunden/freigesetzt werden (́´obligatory order´́) oder ob deren Reihenfolge<br />
willkürlich ist ('random'). Die Entscheidung zwischen diesen Grenzsituationen lässt<br />
sich dann fällen, wenn man Kinetiken von vorn herein in Gegenwart eines der<br />
Podukte durchführt, das die Kinetik als Produktinhibitor beeinflusst.<br />
Eigentlich sollte man erwarten, dass ein Produkt den Umsatz des Substrates aus dem es<br />
entstanden ist, in kompetitiver Weise (c) hemmt. Gegenüber dem Cosubstrat sollte es<br />
nichtkompetitiv (nc) wirken, da es Anteile des Substrates verdrängt und somit maximale<br />
Reaktionsgeschwindigkeit nicht zulässt. Tatsächlich hängt das Resultat jedoch von dem<br />
zugrundeliegenden Mechanismus ( ´obligatory/random order´ ́) ab. Diesen Umstand nutzt<br />
man zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus, denn es gilt:
96<br />
Tricks<br />
Mechanismus hemmendes variables Substrat<br />
(bi-bi) Produkt (Cosubstrat nicht sättigend)<br />
A(NADH,H + )<br />
B(Pyr)<br />
geordnet P(NAD + ) nc 35 nc 36<br />
Q(Lac) c 37 nc 38<br />
willkürlich P(NAD + ) c 39 c 40<br />
Q(Lac) c c<br />
Um einem Verständnis näherzukommen, muss man wissen (Kopfzeile Abb. 8.15):<br />
• Im Falle des geordneten Mechanismus hat das Leitsubstrat A (NADH,H + ) vor dem<br />
Folgesubstrat B (Pyruvat) zu binden und das Leitprodukt P (NAD + ) hat das Enzym<br />
vor dem Folgeprodukt Q (Lactat) zu verlassen;<br />
• gleichzeitig existieren keine Komplexe aus Enzym und Folgesubstrat bzw.<br />
Leitprodukt (d.h. es gibt keine Komplexe EB bzw. EP; Bisswanger, 1994,<br />
'Enzymkinetik', p. 138f). 41 Mischformen wie EAQ und EBP existieren nicht!<br />
35<br />
A,B treffen auf E; P kann sich nur mit EQ verbinden, was Konversion von B voraussetzt. Steigende [A] beschleunigt EPQ-Bildung<br />
V max wird nicht erreicht, da EPQ-Dissoziation durch P behindert wird: nichtkompetitiv (nc).<br />
36<br />
A,B treffen auf E. P kann sich nur mit EQ verbinden, was Konversion von B voraussetzt., Steigende [B] beschleunigt EPQ-Bildung<br />
V max wird nicht erreicht, da EPQ-Dissoziation durch P behindert wird: nichtkompetitiv (nc).<br />
37<br />
A,B treffen auf EQ. Da es keinen Komplex EAQ gibt, steht A in Kompetition zu Q: steigende [A] führen zur Verdrängung des<br />
störendenden Nachbarn wobei V max erreicht wird, K m aufgrund der Kompetition jedoch steigt: kompetitiv (c).<br />
38<br />
A,B treffen auf EQ. Steigende [B] kann Q nicht verdrängen, da Bindung von B nur an EA erfolgen könnte. V max kann nicht erreicht<br />
werden, da Bindungsplatz für A stets nur teilgesättigt:sein kann: nichtkompetitiv (nc).<br />
39<br />
A,B treffen auf EP. Steigende [A] ist in der Lage, das im selben Bindungplatz befindliche Produkt zu verdrängen, so dass V max<br />
erreicht wird: kompetitiv (c).<br />
40<br />
A,B treffen auf EP. Steigende B verdrängt P aus Nachbarbindungsplatz, da EPB nicht existieren kann. V max wird erreicht, da<br />
Dissoziation von Q aus EPQ durch P nicht behindert wird: kompetitiv (c). Usw....<br />
41 Abb. 8.15 (umseitig): sequenzieller (= geordneter) bi-bi Mechanismus.<br />
Das Leitsubstrat A (NADH,H + ) muss assoziiert sein, bevor das Folgesubstrat B (Pyruvat) assoziieren kann. Das<br />
Leitprodukt P (NAD + ) muss den EPQ-Komplex verlassen, bevor Q (Lactat) aus EQ abdissoziieren kann.<br />
Komplexe EAQ und EBP (Edukt und Partnerprodukt) gibt es igrundsätzlic nicht. Komplexe EP bzw. EB und EAQ<br />
haben beim sequenziellen bi-bi Mechanismus keine Existenzberechtigung. Im Gegensatz hierzu<br />
assoziieren/dissoziieren beim random bi-bi Mechanismus alle Substrate/Produkte in beliebiger Folge. Daher<br />
würden auch Komplexe des Typs EB und EP existieren. Alle Situationen in Abb. 8.15 tragen die Nummer der<br />
Fußnote, in der sie beschrieben werden.
97<br />
Tricks
98<br />
Tricks<br />
8.14.2 Ping-pong bi-bi Mechanismus<br />
Hier wird bereits ein Produkt nach Bindung des ersten Substratmoleküls freigesetzt („Ping“). E geht<br />
dabei in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat bei Bildung des zweiten<br />
Produktes reagiert („Pong“). E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphat-Komplex, der mit einer<br />
Aminosäure reagiert, F ein Transaminase-Pyridoxamin-Komplex, der eine Ketosäure umsetzt.<br />
Die Lineweaver-Burk Auftragung zeigt für diesen Fall die Charakteristika einer unkompetitiven<br />
Inhibition: die katalytische Effizienz (Kap. 8.2; hier: Steigung, bzw. Quotient V max/ K m )<br />
bleibt konstant. Hilfsvorstellung: dies ist eine Folge der Tatsache, dass der erste Substratumschlag<br />
bereits in Abwesenheit des zweiten Substrates erfolgt, so dass die Tangente an den Ursprung einer<br />
MMenten-Funktion ihre Steigung nicht ändert (Abb. 8.2.1).<br />
Abb. 8.14: Verhältnisse beim Ping-pong bi-bi Mechanismus. Ein Produkt wird bereits nach Bindung<br />
des ersten Substratmoleküls freigesetzt.<br />
E geht in eine andere Enzymform (F) über, mit der das zweite Substrat unter Bildung des zweiten Produktes<br />
reagiert. E ist z.B. ein Transaminase-Pyridoxalphosphatkomplex, der mit einer Aminosäure reagiert, F ein<br />
Transaminase-Pyridoxaminkomplex, der eine alpha-Ketosäure umsetzt.<br />
TRICKS UND ' trouble-shooting'<br />
9.1 Funktioniert das Photometer?<br />
(Auszug aus "Boehringer Mannheim GmbH: Testfibel")<br />
Prüfung: ca. 500 mg Kaliumhexacyanoferrat-(III) in 500 ml aqua dest. lösen (E =1). Mit aqua 1+1, 1+3<br />
und 1+9 Verdünnungen herstellen und die vier Lösungen bei 355 nm gegen Wasser messen; die<br />
Chemikalie weist hier ein Extinktionsminimum nahe der sonst meist verwendeten Wellenlänge von<br />
340 nm auf. Messungen in Minima oder (vorzugsweise) Maxima sind verlässlicher als solche an der<br />
Flanke einer Absorptionsbande. Die abgelesenen Extinktionswerte müssen sich wie 1:0.5 bzw. 1:0.25<br />
und 1:0.1 verhalten, dann spricht das Photometer linear auf Konzentrationen (Extinktionen) an.<br />
Die Absolutwerte der drei Lösungen sollten 1, 0.5, 0.25 und 0.1 betragen und<br />
können zum Vergleich verschiedener Photometer untereinander verwendet werden.<br />
9.2 Optimierung der Versuchsbedingungen bei schlecht auswertbaren<br />
Kinetiken<br />
Anfangssteigungen sind nicht ablesbar, weil<br />
- die Reaktion zu schnell abläuft: Enzymkonzentration senken,<br />
- die Reaktion zu langsam verläuft: Enzymkonzentration anheben.<br />
falls der erwartete Endpunkt nicht erreicht wird: eines der Cosubstrate limitiert<br />
die Reaktion,<br />
- der Reaktionsverlauf keinen linearen Anfangsbereich aufweist: Kon-
99<br />
Tricks<br />
zentrationen der Cosubstrate liegen weit unterhalb der K m -Werte; höhere<br />
Konzentrationen wählen: alle Substrate bis auf jenes, dessen K m -Wert<br />
bestimmt wird, sollten in sättigender Konzentration vorliegen;<br />
Falls dies alles nicht hilft:<br />
es ist die integrierte Michaelis-Menten Gleichung im kompletter Form zugrunde zu<br />
legen (diskutiert durch N.G. Karanth & A.K. Srivastava Biochim. Biophys. Acta 615,<br />
279,1980):<br />
1 Km ln( So<br />
/ St)<br />
1<br />
S<br />
= ⋅ + mit:<br />
v =<br />
v V max S − S V max<br />
o<br />
t<br />
Diese kann z.B. zur Auswertung von 'fixed-point'-Messungen herangezogen werden (R. G. Duggleby<br />
(1991), Biochim. Biophys. Acta 1078, 124-125); dieses Verfahren umgeht die schwierige Ermittlung<br />
von Anfangssteigungen völlig, d.h.:<br />
...the time to reach a predetermined product concentration, [P * ], is determined for various substrate<br />
concentrations [S o ]. This time is given by t = [P * ]/V max -(K m /V max ) . ln(1-[P * ]/[S o ]. The fixed point which is<br />
recommended is half the lowest substrate concentration. A plot of t vs. -ln(1-[P * ]/[S o ]) will then be a straight<br />
line with a slope of K m /V max and an intercept of [P * ]/V max permitting the easy calculation of K m and V max .<br />
Der Computer erweist sich hier als nützliches Hilfsmittel. Geben Sie in Composit (Optionen<br />
[S]ubstrate/(F]ixed point method) den 'fixed point' ein. Sodann geben Sie für jede Substratkonzentration<br />
die zum Erreichen von [P * ] erforderliche Zeit t ein und verfolgen Sie, wie der<br />
Computer Ihnen durch nichtlineare Regression K m und V max ermittelt.<br />
o<br />
− S<br />
t<br />
t<br />
Schließlich übernimmt der Computer auch die Aufgabe, aus einer Zeit-Umsatzkurve<br />
die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ('Anfangssteigung') zu ermitteln. Hierfür<br />
stehen zwei Optionen zur Verfügung:<br />
9.2.1 Anfangsgeschwindigkeiten aus der integrierten Michaelis-Menten<br />
Gleichung<br />
M.J.C. Crabbe in "Microcomputers in Biology", IRL Press (1984, C.R. Ireland & S. P. Long, Ed.,<br />
pp121<br />
Im strikten Sinne bezieht sich die integrierte Michaelis-Menten Gleichung auf<br />
irreversible (durch Produktanhäufung nicht inhibierte) Einzelsubstrat-Reaktionen.<br />
Dennoch erlaubt ihre Anwendung auch für komplexere Reaktionen eine verlässliche<br />
Ableitung der Anfangsgeschwindigkeit. Hierfür ist Kenntnis über die<br />
Substratkonzentration zum Zeitpunkt t = 0 ([NADH,H + ] bei Reaktionsbeginn) bzw.<br />
der Produktkonzentration zum Zeitpunkt t = 4 erforderlich. Das Programm V0<br />
unterscheidet entsprechend einen [S]- und einen [P]-Fall. Im [P]-Fall übernimmt V0<br />
die Abschätzung des Wertes P oo , erlaubt jedoch dessen Eingabe, sollten Daten<br />
vorliegen.
100<br />
Tricks<br />
9.2.2 Anwendung eines Polynoms zur Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeit<br />
aus Zeit-Umsatzkurven<br />
J. T.-F. Wong, "Kinetics of Enzyme Mechanism", Academic Press 1975, pp 5<br />
Der Verlauf der Produktkonzentration [P] während einer enzymatischen<br />
Umsetzung kann durch ein Polynom zweiter oder höherer Ordnung, etwa der Form<br />
[P] = a o + a 1 t + a 2 t 2 + a 3 t 3 ...<br />
angeglichen werden, wobei durch eine wachsende Zahl an a n -Gliedern eine<br />
zunehmend bessere Anpassung erzielt wird. Im einfachsten Fall {[P] = a o + a 1 t} hätte<br />
man es mit der Angleichung an eine Gerade zu tun, wobei a 1 die Steigung und a o<br />
der Ordinatenschnittpunkt wären; a 1 und a o behalten eine analoge Bedeutung auch<br />
für ausgedehntere Exponentialreihen. Im Falle einer optimalen Anpassung wird a 1<br />
somit zur Anfangssteigung (bzw. Anfangsgeschwindigkeit).<br />
Anwendung: im Programm Composit findet man in der Sektion [S] die Option<br />
[P]rogress curve (via 'power series'). Bei der nachfolgenden nichtlinearen<br />
Regression werden die Parameter a o bis a 3 angeglichen. Der optimierte Parameter<br />
a 1 kann dann als Anfangsgeschwindigkeit interpretiert werden. 42 , 43<br />
1 3<br />
1<br />
0.48<br />
5<br />
Substrate<br />
3<br />
1<br />
Abb. 9.1: Angleichung einer ungewöhnlichen (PFK) Zeit-Umsatzkurve vom [S]-Typ mit Hilfe eines<br />
Polynoms vierter Ordnung.<br />
Beispiel-file ṕrogkuŕ. Eine vorherige Substrat-Produkt-Konversion ist hier möglich, aber nicht nötig (überspringen<br />
mit [S]kip). -0.48 entspricht der Anfangssteigung ( Tangente an den Ursprung).<br />
42 Der Parameter a o sollte bei dieser Angleichung klein bleiben, andernfalls verliefe die Kurve nicht<br />
durch den Ursprung (t=0/P=0). Dies kann bei einem schlecht definierten Anfangspunkt auftreten<br />
(Phänomen eines 'offset', der so identifiziert werden kann). Verlauf der Kurve durch den Punkt 0/0<br />
kann gegebenenfalls durch "Maskierung" des Parameters a0 "erzwungen" werden. Näheres im<br />
Anhang (Ausführungen zu Composit).<br />
43 Die verkürzte Gleichung in der Form Y = a o + a 1 x stellt eine Gerade dar und kann durch Festhalten<br />
von a 2 und a 3 bei 1E-28 erzeugt werden. Zusätzliches maskieren von a o bei 1E-28 erzeugt eine<br />
Gerade durch den Ursprung (0/0).
101<br />
Tricks<br />
10. ZUR BEDEUTUNG VON CYSTEINEN FÜR ENZYMATISCHE AKTIVITÄTEN<br />
(REAKTIONSKINETIK)<br />
Literatur: Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day Inc. (1964), S. 155<br />
Abb. 10.1: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (NBS 2 bzw. "Ellman's Reagens”) reagiert mit freien,<br />
deprotonierten Sulfhydrylgruppen, z.B. aus Proteinen. Für jede abreagierte Thiolgruppe wird wird ein<br />
Thionitrobenzoat-Anion frei. Das stark gelb gefärbte Anion kann aufgrund seiner Extinktion bei 412 nm<br />
quantifiziert werden (ε 412 = 1.36x10 4 bei pH 8). NBS 2 wird auch als reversibel modifizierendes Reagens für die<br />
Modifikation von Proteinen benutzt. Behandlung des Phosphorylase b-Dimers ergab z.B. Thiolgruppen zweier<br />
Reaktivitäten. Darunter hatten zwei hochreaktive Reste keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität, die jedoch<br />
parallel zu einer Gruppe wenig reaktiver Thiole abnahm (Damjanovich und Kleppe, Biochim. Biophys. Acta 122,<br />
145, 1966).<br />
Sulfhydrylgruppen können, oberhalb ihres pK a -Wertes, spezifisch durch SH-SS-<br />
Austausch mit Disulfid-Reagenzien modifiziert (oxidiert) werden. Durchführung in<br />
8 M Harnstoff (d.h. unter denaturierenden Bedingungen im leicht alkalischen Milieu)<br />
ermöglicht die colorimetrische Erfassung aller Cysteine eines Proteins, während im<br />
nativen Zustand nur die exponierten bzw. aktivierten SH-Funktionen nachweisbar<br />
sind<br />
44<br />
Die folgenden Versuche dienen dazu, den Gesamtgehalt von<br />
Dehydrogenasen an Cysteinen sowie die Zahl der reaktiven bzw. an der Katalyse<br />
beteiligten Cysteinreste zu bestimmen.<br />
10.1 Zur Auswertung von Kinetiken für Reaktionen zweiter Ordnung<br />
Für eine Reaktion zweiter Ordnung vom Typ<br />
44 Anstelle eines chromogenen Substrates kann in einem solchen Ansatz auch ein fluorogenes<br />
Substrat wie BIPM ([p-(2-benzimidazoly)phenyl]maleimid) eingesetzt werden.. Dabei ergibt sich ein<br />
erheblicher Empfindlichkeitsgewinn, vergl. J. Bode & K. Wagner (1980) Cooperative exposure of<br />
histone H3 thiols in core particles. Int. J. Biol. Macromol. 2, 129-136.
102<br />
Tricks<br />
S + R → P<br />
gilt das Geschwindigkeitsgesetz<br />
1)<br />
− dS<br />
dt<br />
= k⋅S⋅R<br />
mit S, R, Konzentration der Reaktionspartner zum Zeitpunkt t und k,<br />
Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung. Integration dieser Gleichung führt zu<br />
2)<br />
S<br />
o<br />
1<br />
− R<br />
o<br />
S⋅<br />
R<br />
ln<br />
R⋅<br />
S<br />
o<br />
o<br />
= k⋅t<br />
worin sich S und R noch mit Hilfe der Produktkonzentration P zum Zeitpunkt t und<br />
den Konzentrationen zu Beginn der Reaktion, S o und R o , ausdrücken lassen:<br />
3) S = S − P;<br />
R= R − P<br />
o<br />
o<br />
2) ist die Gleichung einer Geraden. Zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten<br />
k wäre der rechts vom Gleichheitszeichen stehende, komplexe<br />
Ausdruck als Funktion der Zeit aufzutragen; k entspräche unter diesen Umständen<br />
der Steigung.<br />
10.1.1 Reaktion zweiter Ordnung unter "Pseudo-First-Order"<br />
Bedingungen<br />
Ist Reaktionspartner R ein Reagens, das ohne Nachteil in großem Überschuss<br />
eingesetzt werden kann, so ändert sich seine Konzentration im Verlauf der Reaktion<br />
nur unwesentlich. Unter diesen Bedingungen gilt mit hinreichender Näherung:<br />
4) R = R o (sog. "pseudo-first-order" Bedingung)<br />
Als Konstante kann R o dann mit k zusammengefaßt werden:<br />
5) k' = k . R o ,<br />
wodurch sich (1) vereinfacht zu<br />
6)<br />
dS<br />
− = k′⋅S<br />
dt<br />
Diese Beziehung ergibt nach Integration den Ausdruck<br />
S<br />
S<br />
7) ln = 2. 303log<br />
= − k′⋅<br />
t<br />
S<br />
So<br />
o<br />
Fertigt man ein Diagramm mit log S/S o vs. t an, so folgt k' aus der negativen<br />
Steigung:
103<br />
Tricks<br />
8) k' = 2,303 × m<br />
Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung wäre dann nach (5):<br />
k m<br />
9) k = ′ 2303⋅ .<br />
=<br />
R R<br />
o<br />
o<br />
10.2 Versuch F1: Titration aller Cystein-Reste an GAPDH<br />
Substanzen:<br />
1) 0.1 M Na-phosphat, pH 8 (z.B. ansetzen durch Mischen von 0.1 M Lösungen<br />
von NaH 2 PO 4 und Na 2 HPO 4 )<br />
2) 0.4 M Na-phosphat, 8 M Harnstoff, pH 8 (unbedingte pH-Kontrolle<br />
und -Korrektur nach Harnstoffzugabe!!!)<br />
3) 19 mg (NBS) 2 in 10 ml 1) ε 412 = 13 600<br />
4) Enzym in einer Konzentration von 0.5 mg je ml 1) bzw. 2).<br />
GAPDH ist in (2) aufzunehmen, auf eine Konzentration von 0.5 mg/ml zu bringen<br />
(vergl. Kapitel 1.2.1) und zur vollständigen Denaturierung 15 min in diesem Medium<br />
zu belassen. Man fülle 2 ml der Lösung in eine Küvette und eiche das Photometer<br />
auf E 412 = 0. Zusatz von 50 µl des Reagenz (Lösung 3) bewirkt Gelbfärbung, die als<br />
Extinktion bei 412 nm zu messen ist. Die erhaltene Ablesung sollte für die<br />
geringfügige Eigenextinktion des (NBS) 2 korrigiert werden. Hierfür eicht man das<br />
Photometer mit 2 ml (2) auf E 412 = 0, fügt 50 µl (3) hinzu und liest ab. Der korrigierte<br />
Wert dient dann zur Ermittlung der Cystein-Zahl je 144 000 g Enzym (d.h. je mol).<br />
Hierfür ist lediglich zu kalkulieren, wie viel fach die Molarität von NBS - jene der<br />
vorgelegten GAPDH übersteigt.<br />
10.3 Versuch F2: Untersuchung von Cystein Reaktivitäten in nativer GAPDH<br />
Durchführung wie Versuch F1, jedoch in Abwesenheit von Harnstoff (Puffer 1<br />
anstelle von 2). Da ein Endwert für E 412 auch im Verlauf von Stunden nicht zu<br />
erreichen wäre, verfolgen Sie die Reaktion über 30 Min. und verwenden Sie als Wert<br />
E oo die unter F1 erzielte Ablesung.<br />
Eine kinetische Analyse des Versuches wird, wie gesagt, dadurch erleichtert,<br />
dass unter "pseudo-first-order" Bedingungen (d.h. Reagenzüberschuss) gearbeitet<br />
wird, denn hier gilt<br />
− dSH [ ]<br />
= kNBS [ ] ⋅[<br />
SH<br />
dt<br />
2<br />
]<br />
Da (NBS 2 ) >> (SH) und damit während der Reaktion praktisch konstant ist, ergibt<br />
sich mit k(NBS 2 ) = k' die leicht integrierbare Beziehung
104<br />
Tricks<br />
− dSH [ ]<br />
SH<br />
10) ; 11)<br />
= k′ [ SH]; ln [ ] = − k′⋅t<br />
dt<br />
[ SH ]<br />
Da der ursprünglich bereitstehende Teil an SH-Funktionen, (SH) o , der End-extinktion<br />
bei 412 nm (E4) proportional ist und der zum Zeitpunkt t nicht reagierte Teil sich zu<br />
E oo -E t ergibt, lässt sich formulieren:<br />
12) E∞−E<br />
ln<br />
E∞ t<br />
=− k′⋅t<br />
o<br />
y<br />
= m . x<br />
(12) ist die Gleichung einer Geraden. Folglich ergibt eine Auftragung von ln (E oo -<br />
E t /E oo ) vs.t, im Falle gleicher SH-Reaktivitäten, eine gerade Linie; ein nicht<br />
geradliniger Verlauf deutet auf eine zusammengesetzte Reaktion hin, wie im<br />
folgenden Beispiel:<br />
Abb. 10.2: Zusammengesetzte Reaktion der 13 Cys-Reste<br />
eines Proteins.<br />
Die Reaktivitäten sind durch folgende Geschwindigkeitskonstanten<br />
gekennzeichnet: ḱ = 0.65 (7 Reste); ḱ = 0.048 (6 Reste). Die<br />
"späte" Steigung (auslaufender Ast) charakterisiert die letztere<br />
Gruppe. Subtraktion der Ordinatenwerte entlang der extrapolierten<br />
Steigung von den gemessenen Werten ergibt die erste Gruppe.<br />
Die Ordinatenabschnitte von 0.43 bzw. 0.57 stehen für die Reaktivitätsanteile.<br />
Zur Ermittlung der "wahren" śecond-ordeŕ<br />
Geschwindigkeitskonstanten wären die Werte für ḱ durch die<br />
Reagenskonzentration zu dividieren (Gleichung 9)<br />
nach W. J. Ray und D.E. Koshland, J. Biol. Chem. 236 (1961),<br />
1973.<br />
Die Kinetik der Umsetzung von GAPDH mit (NBS) 2 ist nach Art der obigen Abbildung<br />
auszuwerten (halblogarithmisches Papier im Anlagenteil) bzw. mit Unterstützung<br />
durch das Programm MMenten (Option Inhibition [I]rreversibel) oder auch durch das<br />
Demonstrationsprogramm Emod.<br />
Die eleganteste Auswertung wird allerdings über das Programm Composit (Option Inhibition<br />
[I]rreversible) ermöglicht. Dieses Programm ist für die direkte Anpassung der Messwerte an sechs<br />
Parameter (drei Geschwindigkeitskonstanten und drei individuelle A-Werte) eingerichtet. Bei<br />
Problemen<br />
kann vereinfachend durch Definition von A 3 und k 3 als 1E-28 45 sowie Maskierung dieser Werte eine<br />
Vierparameter-Anpassung erzwungen werden.<br />
45 Festsetzen von Parametern als "null" ist nicht erlaubt: bringt den Computer zum Absturz
105<br />
Abb. 10.3: Reaktion der GAPDH mit (NBS) 2 (aktuelles Praktikumsbeispiel).<br />
Links: Reaktionskinetik über 30 Minuten. Rechts: Datentransformation im halblogarithmischen Diagramm (hier:<br />
demonstriert anhand des Programmes Emod).<br />
- GAPDH enthält superreaktive SH-Gruppen in den aktiven Zentren, die im<br />
Millisekundenbereich reagieren (Zahl ?) neben reaktiven SH-Gruppen nahe<br />
den aktiven Zentren (Sekundenbereich; Zahl ?) und mäßig reaktiven SH-<br />
Gruppen (Minuten-Stundenbereich; Zahl?).<br />
11. APPENDICES<br />
- Anleitung zum Gebrauch der <strong>Enzkin</strong> Programme<br />
- Enzymkinetik in Wikipedia<br />
- Geometrische Eigenschaften einer Hyperbel<br />
- Transformationen der Michaelis-Menten Beziehung<br />
- Lösungsweg zur Aufgabe B0<br />
- Halblogarithmisches Papier
106<br />
Seminarthemen:<br />
1. Di - Moderation der Fragensammlung “Dienstag”<br />
1. Di (T) - Maßeinheiten enzymatischer Aktivität und deren Bestimmung (27-28, 35-<br />
37<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Michaelis-Menten-Theorie)<br />
1. Mi Steady-State Kinetik: Besonderheiten und experimentelles Vorgehen (62-63,<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Fließgleichgewicht, Lehrbücher)<br />
1.Mi (T) - gekoppelte enzymatische Tests in der klinischen Biochemie und ihre<br />
Alternativen (31,32)<br />
1. Mi (T) - Welche Aussagen erlaubt die Kenntnis der freien Standardenthalpie für<br />
enzymatische Umsetzungen und wie wird sie bestimmt? (37-41)<br />
1. Do (T) - Eigenschaften und Anwendungen der Biolumineszenzmethode (50-51,<br />
Skript 3:Do)<br />
1. Fr. (T) - Phosphofructokinase: ein regulatorisches Schlüsselenzym in Tieren<br />
(Leber) und Pflanzen (54, http://de.wikipedia.org/wiki/Phosphofructokinase)<br />
1. Fr. Glykolytische Oszillation in Hefe (Analyt. Sci. 17 Suppl i363-i366 2001)<br />
1. Fr. (V) -Phosphofructokinase: wie erfasst man Regulation und Allosterie (56-61)?<br />
1. Fr. (T) - Allosterie und Kooperativität (72, http://de.wikipedia.org/wiki/Allosterie<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Kooperativität)<br />
1. Fr. (T) - zur "katalytischen Effizienz": Konzept und Aussagekraft (63-65)<br />
2. Mo (T) - Proteinbestimmungsverfahren: Grundprinzipien, Anwendbarkeit und<br />
Einschränkungen (10-16);<br />
2. Mo (T,P) - Proteinaufreinigungsverfahren am Beispiel der GAPDH<br />
2. Mo. (T) - Glycolyseenzyme: ein einziger Multienzymkomplex? TIBS 13, 486-490 1988;<br />
Science 234, 1081-1086, 1986, http://de.wikipedia.org/multienzymkomplexe<br />
2. Di (T) Was weiß man über den katalytischen Mechanismus der GAPDH? (23)<br />
2. Di (T) Die vielen Gesichter der Aldolase (Mol. Cell 11, 885-894, 2003; Science 304, 248-253<br />
2005)<br />
2. Di (T) GAPDH, ein Protein mit vielfältigen Funktionen (Biochem. Biophys. Res. Commun. 275,<br />
253-260 2000, Cell 114, 150-152, 2003)<br />
2. Di. (T,V) - Was sagen uns sekundäre plots? (83, 95)<br />
2. Mi. (T) - Linearisierungen der Michaelis-Menten-Gleichung: Aussagekraft und<br />
Limitationen (71)<br />
2. Mi.16 (T) - Besonderheiten von Mehrsubstrat-Reaktionen 94-98<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/Mehrsubstrareaktion
107<br />
<strong>Enzkin</strong><br />
Enzymkinetik und -mechanismus<br />
(BB3 2005) 46<br />
Bootdiskette oder: Installieren (INSTALL\)<br />
DOS-Programm über EN\ starten<br />
I -<br />
Hinweise zum Installieren der Programme:<br />
a- direkt von Diskette ́booteń (z.B. Diskette in Laufwerk A, Warm- oder Kaltstart des IBM<br />
Computers 47 ) oder:<br />
b- Automatisches Installationsprogramm ÍNSTALĹ von der Diskette aufrufen oder Installation<br />
manuell vornehmen, d.h.<br />
c- auf der Festplatte die Verzeichnisse EN, EN/PR, EN/UT anlegen<br />
- dort hinein alle Dateien von den entsprechenden Verzeichnissen der Diskette kopieren 48 ;<br />
- Batch-Datei EN.BAT in das Stammverzeichnis kopieren; ggf. ṕath́ um Hinweis auf DOS-<br />
Verzeichnis (\dos o.ä.) erweitern, z.B.<br />
c:\<br />
path \en;\en\ut;\en\pr;\ut;\dos<br />
graphics<br />
sk<br />
cls<br />
banner EnzKin /d/h/u<br />
echo Enzyme Kinetics<br />
echo by Jürgen Bode {2000}<br />
cd\en<br />
auto<br />
- Programmmenu über den Befehl EN\ aufrufen;<br />
46 Vervielfältigen der EnzKin-Diskette:<br />
- Windows95/98/NT: Arbeitsplatz/Diskette (A:)/Datei/Diskette kopieren<br />
Quelldiskette<br />
Zieldiskette<br />
3.5-Diskette (A:) 3.5-Diskette (B:)<br />
- DOS: A:<br />
DISKCOPY<br />
47 Lauffähigkeit der DOS-Programme wurde für Windows 3.*, 9*, 2000 und ME getestet und bestätigt<br />
48 Alle lauffähigen Programme finden sich in \en\pr und können auch durch direkten Aufruf gestartet werden.
108<br />
II -<br />
a -<br />
b -<br />
Aufzeichnen und Abspeichern von Messdaten<br />
über die Dateneingaberoutine, die (fast) jedem Programm mitgegeben wurde;<br />
alle Files werden automatisch im Verzeichnis \EN abgelegt<br />
über die generelle Dateneingaberoutine ḾAKAFIĹ die verschiedene in COMPOSIT verlangte<br />
Formate anlegt. Die dort gestellten Fragen sind wie folgt zu beantworten:<br />
- [C]reate, [L]ink or [C]onvert files : C\<br />
Funktion [L]ink kommt erst bei Inhibitionsstudien zum Tragen. Dort können mehrere<br />
einzelne Messreihen zu einem ćomposit filé vereinigt werden. Funktion [C]onvert<br />
bereitet den Import/Export von Datenreihen aus/in andere(n) Programmen vor.<br />
- enter number of data sets 61> : \<br />
Jede Messreihe ist ein Datensatz (́default́= 1). Abweichende Angaben nur bei<br />
Inhibitionsmessungen.<br />
- number of data points in set 1 (Beispiel : 5 \ )<br />
bei fünf Messpaaren der Art Źeit, Extinktioń.<br />
- enter x, y (Beispiel : 2, 0.8 \ )<br />
für eine Messung nach 2 Minuten von 0.8 Extinktionseinheiten. Eingabe von<br />
Messreihen immer mit dem ersten Messpunkt (kleinster Wert x) beginnen. Keinen (!)<br />
Wert 0, 0 eingeben.<br />
c -<br />
mit Hilfe eines beliebigen Text-Editors im ASCII Format (z.B. "Edit", "Wordpad")<br />
nach gleichzeitigem Druck beider śhift́ Tasten kann über die [N]otizbuch-Funktion ein<br />
einfacher Texteditor ("Sidekick") aufgerufen werden. Dieser kann zur Eingabe von<br />
Werten oder zur Korrektur bereits vorhandener Datenfiles benutzt werden.<br />
In der [N]otizbuchfunktion werden am oberen Rand alle unter \EN abgespeicherten Files angezeigt.<br />
Durchblättern mit / und Pfeiltasten. Neueingabe eines Files: drücken und und<br />
neuen File-Namen angeben. Falls kein File dieses Namens vorhanden, entsteht beschreibbares Leerfeld.<br />
Zum Trennen der X/Y Werte reicht ein Druck auf die Taste (einfach in Musterfiles SIMPLE.FIL<br />
und COMPOSIT.FIL ansehen). Abspeichern mit .<br />
Rückkehr zur Übersicht ; Eingabe ́*.*́.<br />
Formatbeispiel śimple filé (SIMPLE.FIL):<br />
5 Zahl der (x, y) Messpunkte<br />
1 1.1 Wertepaar (x, y), z.B. (Zeit, Extinktion)<br />
2 1.9<br />
4 2.9<br />
8 4.1<br />
16 4.9<br />
Formatbeispiel ćomposite filé (Inhibitionsmessungen; COMPOSIT.FIL)<br />
2 Zahl der ́data setś<br />
4 Zahl der Messpunkte in śet 1́<br />
0 śide conditionś (Inhibitorkonzentration)<br />
.02 10<br />
.025 13.5<br />
.03 17.5<br />
.1 30<br />
4 Zahl der Messpunkte in śet 2́<br />
5 śide conditionś (Inhibitorkonzentration)<br />
.02 2.5<br />
.025 3.3<br />
.03 4<br />
.1 5.3
109<br />
Bitte alle im Praktikum generierten Daten nach folgendem Schema abspeichern (Beispiel):<br />
G2E1.050<br />
(Für: Gruppe 2/VersuchE1/Inhibitorkonzentration 50.)<br />
Bitte beachten (!!)<br />
- Alle Datenfiles aus dem Praktikum sollten mit dem Buchstaben “G” beginnen, damit sie später gemeinsam<br />
kopiert bzw. gelöscht werden können);<br />
- bitte im Protokoll auf diese Datenreihen Bezug nehmen (den Betreuern zuliebe, die gerne wissen,<br />
auf welcher Grundlage ein Ergebnis/eine Interpretation beruht).<br />
III Einlesen gespeicherter Messdaten<br />
Eine typische Eingangsfrage der Programme lautet<br />
enter [D]ata, use the [E]xample or read a [F]ile<br />
Das Einlesen eines files wird durch den Tastendruck F \<br />
eingeleitet.<br />
Tastendruck D \ : Aufrufen der mitgegebenen Dateneingaberoutine;<br />
Tastendruck E \ : Aufrufen eines Arbeitsbeispiels. Mit Hilfe dieses Beispiels wurde das<br />
jeweilige Programm entwickelt. Ein Probelauf mit dieser Option sollte eine detaillierte<br />
Gebrauchsanweisung ersetzen.<br />
IV Abspeichern angeglichener Messdaten<br />
Die meisten Programme gleichen die Messdaten durch “nichtlineare Regression” an ein<br />
mathematisches Modell an. Somit wird aus dem obigen Formatbeispiel śimple filé z.B. ein file<br />
5<br />
1 1.117694<br />
2 1.902887<br />
4 2.933184<br />
8 4.022024<br />
16 4.938678<br />
Dieser ́file ẃird nach der Abfrage<br />
save fitted data on disk<br />
[P]roceed or [S]kip<br />
durch Tastendruck P \ gespeichert und steht dann für die weitere Bearbeitung in anderen<br />
Programmen zur Verfügung. Bei diesen “anderen Programmen” ist z.B. an graphische Routinen mit<br />
hoher Auflösung (z.B. GraphPad, Excel) gedacht.<br />
In allen Programmen wird eine vorgeschlagene Option durch P \ eingeleitet bzw. durch S \<br />
übersprungen. Wo vorhanden, erfolgt durch Q \ (für [Q]uit) ein Rücksprung an den<br />
Programmanfang und durch M \ (für [M]ain menu) ein Sprung in das Programmmenu.<br />
V Ausdrucken von Graphiken<br />
... unter DOS<br />
Je nach Rechner oder drücken. Bildschirminhalt wird auf den<br />
Matrixdrucker (LPT1) geleitet. Zum Ausdruck von Graphen muss GRAPHICS.COM<br />
vorinstalliert sein (ist bei unserer Standardeinstellung der Fall).<br />
...unter WINDOWS<br />
- Bild verkleinern mit (Bild darf nicht formatfüllend sein !)<br />
- Taste drücken der Bildschirminhalt wird in die Zwischenablage kopiert;<br />
- MS-Paint öffnen, Bildschirminhalt in das Fenster übertragen (Befehl EINFÜGEN oder<br />
PASTE)<br />
- ggf. Farben invertieren:<br />
” Klicken Sie im Menü "Bild" auf "Farben umkehren".
110<br />
Jede Farbe wird durch die entsprechende Komplementärfarbe ersetzt. Beispielsweise wird aus Weiß die Farbe<br />
Schwarz, aus Rot wird Blau.<br />
- relevanten Bildteil ausschneiden und mit KOPIEREN/EINFÜGEN (bzw. COPY/PASTE) in<br />
das gewünschte Textverarbeitungsprgramm (oder ein neues MS-Paint-Fenster) übertragen.<br />
Jetzt kann gedruckt werden.<br />
... Alternative bis WINDOWS 98:<br />
verkleinert den Bildschirminhalt und zeigt am oberen linken Rand des Bildes das<br />
MSDOS Symbol, dem hier eine besondere Bedeutung zukommt.<br />
- MSDOS Symbol anklicken, im Menu "BEARBEITEN" "MARKIEREN" wählen;<br />
- den ausgewählten Bereich markieren (Maus&linke Taste oder &Pfeiltasten)<br />
- erneut MSDOS Symbol anklicken, im Menu "BEARBEITEN" "KOPIEREN wählen.<br />
oder (wenn vorhanden):<br />
- Symbol für "MARKIEREN" in der Taskleiste anklicken; Graphik markieren;<br />
- Symbol für "KOPIEREN" in der Taskleiste anklicken;<br />
Bildschirminhalt ist in die WINDOWS Zwischenablage gewandert und kann in WINDOWS-Graphik und<br />
Textverarbeitungsprogrammen mit den Befehlen BEARBEITEN/EINFÜGEN abgerufen werden. Vor dem Drucken<br />
sind die Farben des Diagramms ggf. zu invertieren, um das Dokument "schwarz-auf-weiß" zu erhalten. Eine einfache<br />
Möglichkeit hierfür bietet MS Paint unter der Option "BILD/FARBEN UMKEHREN (VI).<br />
VI Bildbearbeitung<br />
So invertieren Sie die Farben in einer Grafik (in Programmen, die Bitmaps verarbeiten<br />
können):<br />
MS Paint<br />
” Klicken Sie im Menü "Bild" auf "Farben umkehren".<br />
Anmerkung: Jede Farbe wird durch die entsprechende Komplementärfarbe ersetzt. Beispielsweise<br />
wird aus Weiß die Farbe Schwarz, aus Rot wird Blau.<br />
Corel Word Perfect<br />
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend<br />
auf "Bild-Tools";<br />
” um die Farben einer Grafik in ihre Komplementärfarben umzuwandeln, klicken Sie<br />
auf "Farbattribute" und anschließend "Farben invertieren".<br />
Um die Farben wieder in die Originalfarben umzuwandeln, klicken Sie erneut auf "Farben invertieren".<br />
Corel Presentations<br />
- Version 7<br />
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend<br />
auf "Format/Bildvorgaben/Invertieren";<br />
- Version 8<br />
” Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grafik , und klicken Sie anschließend<br />
auf das Wort „Grafik“ in der Symbolleiste. Untermenus: „Bildeinstellung/invertieren“<br />
VII Was mache ich wenn....<br />
....ich den Sinn einer vom Computer vorgeschlagenen Option einfach nicht verstehe:<br />
- die nächstliegende Option/Abfrage befindet sich immer in Bildschirm-Mitte. Was auch n och<br />
möglich ist, findet man am unteren Rand; falls auch dies nicht hilft:<br />
- einfach \ (ŕeturń) drücken. In den meisten Fällen gelingt es, den Computer eine plausible<br />
Option ausführen zu lassen.<br />
....ich aus einem Programm (z.B. aufgrund eines Fehlers) nicht mehr herauskomme:<br />
so lange \ (ŕeturń) drücken, bis die nächste Frage gestellt wird. Dann (bzw.<br />
) drücken, um in das Programmmenu zurückzuspringen.
111<br />
Wegweiser anhand des " Composit"-Programms in fünf<br />
einfachen Schritten (‘)<br />
‘ Programmaufruf (́3́ drücken oder Pfeil positionieren und \)<br />
‘ Ś́ drücken<br />
denn es soll der Einfluss der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt, d.h. aus der<br />
hyperbolen Abhängigkeit des v von [S] soll die Michaeliskonstante (K m ) und die Sättigungsgeschwindigkeit (V max )<br />
durch nichlineare Regression abgeleitet werden;<br />
‘ ́H́ drücken<br />
Angleichung der Messwerte an eine Hyperbel; alle Funktionen sind mit einem fest-́verdrahteteń Beispiel (́[E]xamplé)<br />
versehen, das an dieser Stelle aufgerufen werden kann;<br />
‘ É́ drücken<br />
es folgt eine Reihe Optionen, die separat aufgerufen werden können. Für einen ersten Schnelldurchgang reicht es<br />
hingegen, jede Frage durch einen Tastendruck<br />
‘ ́\́ (ŕeturń; mehrfach)<br />
zu quittieren. Der Computer trifft damit eine plausible Auswahl und zeigt in dieser Reihenfolge:<br />
- eine Graphik mit den anzugleichenden Messdaten (Abb. 11.1 links)<br />
- Schätzwerte für K m und V max<br />
- automatische Übernahme der Schätzwerte (eine eigene Eingabe wäre möglich)<br />
- unbeschränkte Parametervariation (ḿaskiereń, d.h. Festhalten eines Parameters und<br />
Festlegen von Parametergrenzen, ́boundś, ist möglich, siehe nächstes Kapitel);<br />
- Verbesserung der Schätzwerte (Minimierung der Summe der Fehlerquadrate, ŚSQ́ in<br />
zehn Durchgängen; Angabe der optimierten Parameter);<br />
- Abweichungen zwischen Messwerten und optimierten Werten der<br />
Reaktionsgeschwindigkeit ́v ́;<br />
- die Möglichkeit, ́v́-Werte für nicht gemessene Substratkonzentrationen [S] zu<br />
interpolieren;<br />
- die Werte für die angeglichene (optimierte) Hyperbel abzuspeichern<br />
z.B. um sie in einem externen Graphikprogramm weiter zu verarbeiten oder für Klausuraufgaben verfügbar<br />
zu haben (!);<br />
- explizite Angabe der optimierten Werte für K m und V max (zum Notieren), sowie die<br />
optimierten Messwerte (z.B. für eine Graphik per Hand);<br />
- eine Graphik, in die zuerst die Originalmesswerte, dann die angeglichenen<br />
Messwerte eingezeichnet werden. Diese Graphik kann durch betätigen der ́Drucḱ-<br />
Taste ausgegeben werden.<br />
Abb. 11.1: Angleichung enzymkinetischer Messwerte (links) durch nichtlineare Regression im<br />
Programm Composit<br />
links: die Originalmesswerte, die an eine Hyperbel (d.h. die MMenten-Beziehung v = V max x<br />
[S]/(K m +[S]) angeglichen werden sollen (́fitted hyperbolá);<br />
rechts: Überlagerung der Originalmesswerte durch die Hyperbel, die durch die geringste Summe der<br />
Fehlerquadrate (ŚSQ́) gekennzeichnet ist. Darunter findet sich ein weiteres, extremes (typisches?)<br />
Beispiel (ÉX0́ aus der abgespeicherten Sammlung von [F]iles.
112<br />
Möglichkeiten beim Gebrauch der Funktionen „mask“ und „bounds“ im<br />
Programm [C]omposit<br />
[C]omposit generiert, zur Durchführung der linearen Regression, Schätzwerte der<br />
anzugleichenden enzymkinetischen Parameter (́definitions and estimateś). Diese können der<br />
Reihe nach durch übernommen werden und erscheinen dann unter énter<br />
estimates of the parameters...́. Statt der Übernahme können an dieser Stelle auch eigene<br />
Schätzwerte eingegeben warden. Anschließend gibt es die Möglichkeit, einzelne oder alle<br />
dieser Schätzwerte zu maskieren (ḿask parameter #́) oder Grenzen (́boundś) vorzugeben,<br />
die bei der Variation eingehalten werden.<br />
Nichtlineare Regression für das<br />
unter [C]omposit/[S]ubstrate/<br />
c[O]operative (Hill) eingestellte<br />
[E]xample. Durch Maskieren des<br />
max Wertes wird eine Anpassung<br />
an drei (statt vier) Parameter erzwungen.<br />
́boundś für n H veranlassen dessen<br />
Variation zwischen den Werten<br />
„null“ und zwei.<br />
ḿasḱ: Im Beispiel der Abb. wurde V max mit großer Sicherheit als ́150́ bestimmt. Der Wert<br />
wird also fixiert (maskiert), d.h. es werden nur die verbliebenen drei Parameter für die<br />
Variation freigegeben.<br />
Es gibt die Möglichkeit, sämtliche Parameter zu definieren und zu maskieren. Der Computer nimmt<br />
dann keine Regression vor, sondern konstruiert eine Bindungskurve zu den vorgegebenen Werten.<br />
Wird die Funktion ́4: offset́ freigegeben, so versucht der Rechner, durch Parallelverschiebung der<br />
Nulllinie eine bessere Anpassung zu erreichen (eine unrichtige Nulllinie kann die Folge<br />
systematischer Messfehler sein!).<br />
́boundś: Die Option gibt Grenzen vor, innerhalb derer bei der nichtlinearen Regression<br />
variiert warden darf. Im Beispiel der Abb. wird der Hill-Koeffizient n H für eine Variation<br />
zwischen [Z]ero und 2 freigegeben.<br />
z.B. da es sich um ein dimeres Protein handelt, bei dem n H aus physikalischen Gründen einen Wert 2<br />
nicht überschreiten kann. Eine untere Grenze [Z]ero, hier 1E-28, verhindert, dass negative Hill-<br />
Koeffizienten (d.h. solche ohne reale Bedeutung) ausgegeben werden.<br />
Angabe einer ĺower bound́ [Z]ero und einer úpper bound́ [I]nfinite würde Variation des Parameters im<br />
positiven Bereich erzwingen. Solche Vorgaben können sinnvoll sein, wenn der Rechner z.B. eine<br />
optimal Anpassung für negative K m -Werte findet. Bitte beachten: die Werte ́0́ oder ́4́ würden den<br />
Rechner unweigerlich zum Absturz bringen, Stattdessen wird ein sehr kleiner (1E-28) bzw. ein sehr<br />
großert Wert (1E28) eingesetzt. Diese Werte sind unteŕ [Z]́ bzw. ́[I]́ voreingestellt.<br />
Beispiel:<br />
Die Bindungskurve des Phenylalanins an Pyruvatkinase in File "Pk-Phe6" (analy. Abb. 7.4)<br />
gibt nach Regression in Composit/[S]ubstrate concentration/[C]ooperative (Adair) die<br />
folgende annehmbare aber physikalisch blödsinnige Angleichung (negative K m -Werte!):<br />
final reports...<br />
Vmax(1) = 100.6784 +/- 5.228411<br />
Km(1) = -156.8362 +/- 936.9321<br />
Km(2) = -.1200704 +/- .7006505<br />
Verwendung der Option ́boundś (Grenzen zwischen "zero" und "infinite") nach folgendem
113<br />
Muster<br />
enter estimates of the parameters...<br />
1 : 100.958<br />
2 : 2523.701<br />
3 : 1.25<br />
mask parameter #<br />
bounds for parameter #2<br />
lower bound ? z<br />
upper bound ? i<br />
bounds for parameter #3<br />
lower bound ? z<br />
upper bound ? i<br />
bounds for parameter #<br />
[A]ccept default set [I]nfinite set [Z]ero<br />
ergibt hingegen deutliche Anzeichen positiver Kooperativität:<br />
final reports...<br />
Vmax(1)= 101.7576 +/- 5.637818<br />
Km(1) = 444.5495 +/- 7681.398<br />
Km(2) = 4.378854E-02 +/- .7631205<br />
Bitte beachten: die ungewöhnlich großen Fehlergrenzen zeigen an, dass hier viele<br />
Kombinationen von Km zu einem ähnlich guten ́fit́ führen würden, der Datenbereich/die<br />
Datenqualität also nicht für eine eindeutige Festlegung ausreicht. Dies kann man durch<br />
unterschiedliche Ergebnisse für verschiedene Eingangsschätzungen demonstrieren.<br />
Demonstration ist auch dadurch möglich, dass Angleichung an eine berechnete Kurve für<br />
V max = 102; K m (1)= 445; K m (2)=.04 (auch ohne Setzen von ́boundś) die folgenden Werte<br />
liefert:<br />
final reports...<br />
Vmax(1)= 102.0077 +/- 4.379309E-03<br />
Km(1) = 432.1519 +/- 6.204851<br />
Km(2) = 4.119895E-02 +/- 5.96386E-04<br />
Übungsaufgabe: Bestimmung der Anfangssteigung einer nichtoptimalen<br />
Enzymkinetik<br />
1 - Schätzen Sie die Anfangssteigung dadurch ab, dass Sie eine Tangente an den Ursprung<br />
(t=0; E=0) legen. Verfahren: Skript, Abb. 4.1.<br />
2 - Bemühen Sie das Programm VO im Programmpaket, d.h.<br />
- Sie haben es hier mit der Bildung von [P]rodukt zu tun;<br />
- Sie möchten Messdaten eingeben [RET];<br />
- Sie geben Messdaten ein (jedes Datenpaar X,Y besteht aus einer Zeitangabe und<br />
der entsprechenden Extinktion; beide Werte sind durch ein Komma zu trennen);<br />
- das Programm benötigt eine Abschätzung für A ; wenn Sie [RET] drücken, nimmt es<br />
diese Abschätzung automatisch vor;<br />
- das Programm nennt Ihnen den Schätzwert für Vo; die Bedeutung dieses Wertes ist<br />
im Skript Abb. 4.2, erklärt; [RET]:<br />
- das Gleiche in graphischer Darstellung analog Abb. 4.2
114<br />
3 - Stimmt Ihre Abschätzung (Tangente an den Ursprung) mit der Computer-Angabe<br />
überein? Diskussion!<br />
Enzymkinetik und -Mechanismus in Wikipedia<br />
http://de.wikipedia.org/wiki/~<br />
anstelle des "~" bitte einsetzen:<br />
Affinität<br />
Allosterie<br />
Base (Chemie)<br />
Biochemische Zyklen<br />
Cori-Zyklus<br />
Crabtree-Effekt<br />
Cyclisches_Adenosinmonophosphat<br />
Energieladung<br />
Enzymaktivität und katalytische Effizienz<br />
Enzymhemmung<br />
Enzymkinetik<br />
exergon<br />
Fließgleichgewicht<br />
Freie Enthalpie*) (http://de.wikipedia.org/w/wiki.phtml?title=Freie_Enthalpie&oldid=2416152 )<br />
Gluconeogenese<br />
Glukose-Stoffwechsel<br />
Glucokinase<br />
Glykolyse<br />
Gruppenübertragungspotential<br />
Insulin<br />
Isoenzym<br />
Kooperativität<br />
Mehrsubstratreaktion<br />
Methode der kleinsten Quadrate (Abschnitt "Enzymkinetik")<br />
Michaeliskonstante<br />
Michaelis-Menten-Theorie<br />
Milchsäure<br />
Milchsäuregärung<br />
Multienzymkomplexe<br />
Oxalessigsäure<br />
Pasteur-Effekt<br />
Phosphofructokinase<br />
Pyruvat<br />
Redox-Potential<br />
Regressionsanalyse*)<br />
(http://de.wikipedia.org/w/wiki.phtml?title=Regressionsanalyse&oldid=1984504 )<br />
Second Messenger<br />
Substratzyklus<br />
Wechselzahl
115
116<br />
Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung (Komponeten in Ćomposit́)<br />
V max × [ S]<br />
v =<br />
Km + [ S]<br />
V<br />
v =<br />
K<br />
1<br />
1<br />
× [ S]<br />
V<br />
+<br />
+ [ S]<br />
K<br />
V max × [ S]<br />
v =<br />
Km + [ S]<br />
nH<br />
2<br />
2<br />
nH<br />
× [ S]<br />
+ [ S]<br />
Hyperbol (Michaelis-Menten)<br />
Doppelt-hyperbol (Isoenzyme)<br />
Kooperativ (Hill )<br />
v =<br />
v =<br />
V max × [ S]<br />
2<br />
[ S ]<br />
Km + [ S] × ( 1 + )<br />
Kis<br />
Vmax[ A][ B]<br />
K K + K [ B] + [ A][ B]<br />
iA mB mA<br />
Substratinhibition<br />
Mehrsubstratreaktionen (8.14)<br />
Allgemeine Inhibitionsgleichung (mixed type)<br />
v =<br />
V max × [ S]<br />
Km(<br />
1+ [ I]<br />
Ki<br />
) + [ S ]( 1+<br />
[ I]<br />
Kis<br />
)<br />
” Kis 6 4 : kompetitiv<br />
” Ki 6 4 : unkompetitiv<br />
” Ki = Kis : nicht-kompetitiv<br />
Kooperative Bindung nach Adair<br />
(hier: allosterisches Protein mit zwei Bindungsplätzen)<br />
V max( a+<br />
2b)<br />
v =<br />
21 ( + a+<br />
b)<br />
a = 1<br />
K<br />
× [ S ]<br />
1<br />
b = 1<br />
K<br />
× 1<br />
2<br />
K<br />
× [ S ]<br />
1 2
117<br />
Lösungsweg zu Aufgabe B0 nach: Lehninger „Biochemistry“ (1979) pp425<br />
Spaltung von Fructose1,6-Bisphosphate zu Dihydroxyacetonephosphate (DAP) und<br />
Glycerinadehyd-3-phosphate<br />
Diese Reaktion wird durch das wohlbekannte Enzym Fructosediphosphat Aldolase<br />
katalysiert, das leicht in kristalliner Form aus Kaninchenmuskelextrakt zu gewinnen ist. Der<br />
Reaktionstyp ist der einer reversible Aldolspaltung, aus welcher zwei verschiedene<br />
Triosephosphate hervorgehen:<br />
Fructose1,6-bisphosphat<br />
89 ∆G°' = +5.73 kcal mol-1<br />
Dhydroxyacetone phosphate + D-Glycerinaldehyd3-phosphate<br />
Obgleich der ∆G 0 ' Wert dieser Reaktion stark positiv ist, verläuft die Reaktion unter<br />
zellulären Bedingungen ohne Schwierigkeiten. Dies soll im folgenden durch zwei Ansätze<br />
belegt werden:<br />
A – Berechnen Sie ∆G für den Fall, dass die Konzentration aller Reaktionspartner 1E-3 M<br />
beträgt:<br />
∆G = ∆G ó + RT × ln[P]/[S]<br />
= ∆G ó + RT × ln[(1E-3 x 1E-3)/1E-3]<br />
= ∆G ó + RT × ln1E-3<br />
= 5.73 + 1.99E-3 × 298 × (-6.9)<br />
∆G = +1.61 kcal/mol<br />
B – Berechnen Sie, welchen Anteil DAP und GAP in einem Gleichgewicht haben, in dem<br />
F1.6BP in folgenden Konzentrationen vorliegt:<br />
(a) 1.0 M („Standardbedingungen“)<br />
(b) 0.1 M,<br />
(c) 0.01 M<br />
(d) 0.001 M,<br />
(e)0.0001M.<br />
zuerst wird aus ∆G ó die Gleichgewichtskonstante K ermittelt (Programm "G0"), damit die<br />
Gleichgewichtskonzentration von GAP und DAP bei der jeweiligen F1.6-BP Konzentration:<br />
∆G ó= -RT × lnK<br />
5.73 = -1.99 E-3 × 298 × lnK<br />
5.73 = - 0.59 × lnK<br />
-9.71 = lnK<br />
6E-5 = K<br />
6E-5 = [DAP][GAP] = x 2<br />
1E-3 1E-3<br />
6E-8 = x 2<br />
2.4E-4 = x<br />
In Gegenwart von 1 mM F-2.6BP liegen 0.24 mM DAP bzw. GAP vor (24%)<br />
(a) 0.79% („Standardbedingungen“)<br />
(d) 24%<br />
(b) 2.48%<br />
(e)53.9%<br />
(c) 7.63%<br />
Wenn eine Reaktion mehr Produkte hervorbringt als sie Substrate umsetzt (oder umgekehrt), dann hängt die<br />
Gleichgewichtssituation entscheidend von den Ausgangskonzentrationen ab. Für diesen Fall ist ∆G o’ (K eq ) direkt kein<br />
hilfreicher Parameter. Er sollte dann für die Berechnung der aktuellen Gleichgewichtskonzentrationen benutzt<br />
werden.
118<br />
Index - Stichwortverzeichnis<br />
α-Ketobutyrat .........................................................................................................................90<br />
Transaminase ...........................................................................7, 24, 91, 99, 115, 116<br />
α-Hydroxybutyrat........................................................................................................90<br />
1,3-Bisphosphoglycerinsäure...................................................................................................8<br />
AKTIVITÄTSTESTS...............................................................................................................26<br />
Aldolase und GAPDH.................................................................................................31<br />
Aldolase und Triose-P-Isomerase..............................................................................32<br />
enzyme unit................................................................................................................35<br />
Folin-Ciocalteau-Reagens..........................................................................................35<br />
GAPDH ......................................................................................................................34<br />
GLYCOLYSEENZYME IN GEWEBEEXTRAKTEN....................................................26<br />
Lactat-Dehydrogenase...............................................................................................29<br />
PGK und GAPDH.......................................................................................................30<br />
spezifische Aktivität....................................................................................................35<br />
Triosephosphat-Isomerase ........................................................................................32<br />
Volumenaktivität.........................................................................................................35<br />
Aldolase ...............................................................................................................................117<br />
Alkoholdehydrogenase-Ethanol-Reaktion..............................................................................92<br />
Bicinchoninsäure....................................................................................................................12<br />
Biuret......................................................................................................................................16<br />
Biuret-Methode ......................................................................................................................10<br />
Biuretreaktion.........................................................................................................................12<br />
Bradford .................................................................................................................................16<br />
BSA..................................................................................................................................11, 16<br />
Extinktion....................................................................................................................11<br />
Coenzym................................................................................................................................19<br />
Composit..............................................................................................................................111<br />
Wegweiser ...............................................................................................................111<br />
Dehydrogenasen....................................................................................................................19<br />
Coenzyme ..................................................................................................................19<br />
Diphosphoglycerinsäure (heute: Bisphosphoglycerinsäure)....................................................8<br />
direkt-lineare Auftragung........................................................................................................75<br />
Dixon-Auftragung ...................................................................................................................85<br />
Ablesung von Ki-Werten ............................................................................................85<br />
EDTA .......................................................................................................................................8<br />
ELISA-Reader........................................................................................................................13<br />
energy charge ("Energieladung")...........................................................................................22<br />
<strong>Enzkin</strong> (http://enzkin.de.vu) ....................................................................................................108<br />
Installieren................................................................................................................108<br />
enzyme unit........................................................................................................................8, 35<br />
Enzymhemmung ..............................................................................................................76, 82<br />
allosterische Hemmung..............................................................................................78<br />
kompetitive Hemmung ...............................................................................................77<br />
mixed-type" Hemmung...............................................................................................79<br />
Nomenklaturvorschläge .............................................................................................82<br />
unkompetitive Hemmung ...........................................................................................80<br />
unkompetitive" Hemmung ..........................................................................................80<br />
Enzymsättigung .....................................................................................................................20<br />
Extinktion .................................................................................................................................8<br />
Extinktionsänderung ∆E.........................................................................................................35<br />
Extinktionskoeffizient .............................................................................................................21<br />
Dimension ..................................................................................................................21<br />
Einheit ........................................................................................................................21
119<br />
GAP-Lösung 33<br />
Standardisierung ........................................................................................................33<br />
GAPDH ..................................................................................................................................19<br />
Racker-Bande ............................................................................................................19<br />
GAPDH-NAD+ Komplex ........................................................................................................19<br />
Racker-Bande ............................................................................................................19<br />
Glucagon................................................................................................................................21<br />
Gluconeogenese....................................................................................................................25<br />
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase .......................................................................23<br />
Inhibitoren ..................................................................................................................24<br />
Physikalische Daten des Apoenzyms ........................................................................24<br />
Glycolyse-Enzyme .................................................................................................................17<br />
Hydrazin.................................................................................................................................29<br />
Hydridion................................................................................................................................19<br />
Hyperbol (Michaelis-Menten) .........................................................................................94, 115<br />
Hyperbol (Michaelis-Menten) ...................................................................................116<br />
Inhibitionskonstanten .............................................................................................................93<br />
Isoenzyme..............................................................................................................................91<br />
Km-Werte ...................................................................................................................91<br />
katal .......................................................................................................................................35<br />
kooperativer Bindungsphänomene ........................................................................................73<br />
Lactatdehydrogenase ............................................................................................................25<br />
Lambert-Beersches Gesetz .............................................................................................21, 35<br />
LDH-Reaktion ........................................................................................................................30<br />
Gleichgewichtslage ....................................................................................................30<br />
Lineweaver-Burk Diagramm ..................................................................................................95<br />
Lowry .....................................................................................................................................16<br />
Lysozym...........................................................................................................................11, 16<br />
Extinktion....................................................................................................................11<br />
Mehrsubstrat-Reaktionen.......................................................................................................94<br />
MEHRSUBSTRATREAKTIONEN ..........................................................................................94<br />
Transaminase ...........................................................................................................98<br />
Ping-pong bi-bi Mechanismus....................................................................................98<br />
Random/sequentieller bi-bi Mechanismus .................................................................95<br />
W. W. Cleland ............................................................................................................95<br />
Michaelis-Menten Gleichung ...............................................................................................100<br />
Anfangsgeschwindigkeit.....................................................................................99, 100<br />
Molarität ...................................................................................................................................9<br />
molare Aktivität ......................................................................................................................28<br />
Muskelextrakt.........................................................................................................................28<br />
Präparation.................................................................................................................28<br />
NAD+ ...............................................................................................................................19, 21<br />
Extinktionskoeffizient..................................................................................................21<br />
NADH,H+ .........................................................................................................................20, 21<br />
Extinktionsbande........................................................................................................20<br />
Extinktionskoeffizient..................................................................................................21<br />
Fluoreszenz................................................................................................................20<br />
Nicotinamid-adenin-dinucleotid..............................................................................................19<br />
optische Dichte ........................................................................................................................8<br />
PFK ........................................................................................................................................22<br />
Aktivitätsprofil .............................................................................................................22<br />
Effektoren...................................................................................................................22<br />
Struktur.......................................................................................................................22<br />
Regulation ..................................................................................................................54<br />
Kinetik ........................................................................................................................57
120<br />
Phosphofructokinase: siehe PFK...........................................................................................21<br />
Photometer ............................................................................................................................99<br />
Störungen...................................................................................................................99<br />
Ping-pong bi-bi Mechanismus................................................................................................98<br />
Polynom 100<br />
Anfangsgeschwindigkeit...........................................................................................100<br />
Proteinbestimmungsverfahren ...............................................................................................16<br />
Präzision ....................................................................................................................16<br />
Proteingehalt..........................................................................................................................10<br />
Bicinchoninsäure-(BCA-)Variante ..............................................................................12<br />
Biuret-Methode...........................................................................................................10<br />
Bradford-Test .............................................................................................................14<br />
Coomassie Brillant Blue .............................................................................................14<br />
Eichreihe ....................................................................................................................11<br />
ELISA-Reader ............................................................................................................13<br />
Fluram (Flurescamin)-Methode..................................................................................13<br />
Folin-Ciocalteau-Reagens..........................................................................................11<br />
Methode nach Lowry..................................................................................................11<br />
UV-Methode ...........................................................................................................8, 10<br />
Pyruvatkinase ........................................................................................................................24<br />
Reaktion zweiter Ordnung ...................................................................................................103<br />
Auswertung ..............................................................................................................103<br />
Pseudo-First-Order" Bedingungen ...........................................................................103<br />
Salicylat..................................................................................................................................93<br />
Schreibergeschwindigkeit ......................................................................................................28<br />
sekundäre Plots .....................................................................................................................83<br />
Substratinhibition ...................................................................................................................26<br />
Substratsättigung ...................................................................................................................62<br />
Substratumschlag ..................................................................................................................35<br />
Tangente an den Ursprung ............................................................................................27, 101<br />
Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung ...........................................................116<br />
Allgemeine Inhibitionsgleichung...............................................................................116<br />
Hyperbol (Michaelis-Menten) ...................................................................................116<br />
Transmission............................................................................................................................9<br />
Triethanolamin .......................................................................................................................10<br />
trouble-shooting .....................................................................................................................99<br />
turnover number.....................................................................................................................28<br />
Volumenaktivität.....................................................................................................................35<br />
Zeit-Umsatzkurven.........................................................................................................27, 100
121<br />
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