Enzkin - Elm-Asse-Kultur

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Km/Ki
- Fertigen sie eine Auftragung der Endkonzentration an Citrat (mM; Abszisse)
gegen dessen relative Hemmung an. Ermitteln Sie die Dissoziationskonstante
für Citrat (die hier dessen Inhibitionskonstante gleichen sollte) über das
Programm Composit
(Option [S]ubstratkonzentration [H]yperbol); das Verfahren wird unter D3 für ein
anderes (komplexeres) Inhibitionssystem ausführlich beschrieben
Versuch D2: Phosphofructokinase, ein kooperatives Enzym (?) 20 :
Wie unter 7.1 gezeigt, wird PFK jenseits einer bestimmten ATP-Konzentration zum
allosterischen, d.h. positiv kooperativ arbeitenden Enzym. Dieser Effekt soll bei konstanter
ATP-Konzentration und steigender Gabe an F-6P nachvollzogen und später durch
Computer-Unterstützung mit Hilfe des Programms Composit ausgewertet werden.
Substanzen (außer jenen zu D1):
1a) Testmischung 50 mM Glycylglycin (K + -Salz, pH 7.1)
0.01% Albumin
14 mM Cystein
0.4 mM MgCl 2
Pipettierplan: steigende F-6P Konzentrationen
Testmisch.(1a) 2599 2598 2590 2588 2585 2580 2575 2545 2495 2445 2395
GDH 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl
Glycolyt. Lösung 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
NADH,H (5) 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150
F-6P (4) 1 2 5 7 10 15 20 50 100 150 200
- Warten: F-6P-Depletion -
ATP (2) 21 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150
20 J. V. Passonneau & O. H. Lowry (1962) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7, 10-15, Fig. 2; ATP: 2.3 mM;
F-6P: 0.1-3 mM. T. E. Mansour und C. E. Ahlfors (1968) J. Biol. Chem. 243, 2523-2533 Fig. 7; ATP: 1 mM; F-
6P: 0.1-20 mM in Testmischung 1a (Kooperativität bei pH 6.9 aber nicht bei pH 8.2).
21 Hier könnte es sinnvoll sein, mindestens mit jener ATP-Konzentration zu arbeiten, die im Pipettierplan zu
Versuch D1-A die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ergab. WARUM??