Enzkin - Elm-Asse-Kultur

103
Tricks
8) k' = 2,303 × m
Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung wäre dann nach (5):
k m
9) k = ′ 2303⋅ .
=
R R
o
o
10.2 Versuch F1: Titration aller Cystein-Reste an GAPDH
Substanzen:
1) 0.1 M Na-phosphat, pH 8 (z.B. ansetzen durch Mischen von 0.1 M Lösungen
von NaH 2 PO 4 und Na 2 HPO 4 )
2) 0.4 M Na-phosphat, 8 M Harnstoff, pH 8 (unbedingte pH-Kontrolle
und -Korrektur nach Harnstoffzugabe!!!)
3) 19 mg (NBS) 2 in 10 ml 1) ε 412 = 13 600
4) Enzym in einer Konzentration von 0.5 mg je ml 1) bzw. 2).
GAPDH ist in (2) aufzunehmen, auf eine Konzentration von 0.5 mg/ml zu bringen
(vergl. Kapitel 1.2.1) und zur vollständigen Denaturierung 15 min in diesem Medium
zu belassen. Man fülle 2 ml der Lösung in eine Küvette und eiche das Photometer
auf E 412 = 0. Zusatz von 50 µl des Reagenz (Lösung 3) bewirkt Gelbfärbung, die als
Extinktion bei 412 nm zu messen ist. Die erhaltene Ablesung sollte für die
geringfügige Eigenextinktion des (NBS) 2 korrigiert werden. Hierfür eicht man das
Photometer mit 2 ml (2) auf E 412 = 0, fügt 50 µl (3) hinzu und liest ab. Der korrigierte
Wert dient dann zur Ermittlung der Cystein-Zahl je 144 000 g Enzym (d.h. je mol).
Hierfür ist lediglich zu kalkulieren, wie viel fach die Molarität von NBS - jene der
vorgelegten GAPDH übersteigt.
10.3 Versuch F2: Untersuchung von Cystein Reaktivitäten in nativer GAPDH
Durchführung wie Versuch F1, jedoch in Abwesenheit von Harnstoff (Puffer 1
anstelle von 2). Da ein Endwert für E 412 auch im Verlauf von Stunden nicht zu
erreichen wäre, verfolgen Sie die Reaktion über 30 Min. und verwenden Sie als Wert
E oo die unter F1 erzielte Ablesung.
Eine kinetische Analyse des Versuches wird, wie gesagt, dadurch erleichtert,
dass unter "pseudo-first-order" Bedingungen (d.h. Reagenzüberschuss) gearbeitet
wird, denn hier gilt
− dSH [ ]
= kNBS [ ] ⋅[
SH
dt
2
]
Da (NBS 2 ) >> (SH) und damit während der Reaktion praktisch konstant ist, ergibt
sich mit k(NBS 2 ) = k' die leicht integrierbare Beziehung