Enzkin - Elm-Asse-Kultur

60
Km/Ki
Alle Reaktionen werden durch Zupipettieren der ATP-Lösung gestartet, und der Abfall der
E 340 wird registriert. Verwenden Sie Testmischung 1a und variieren Sie den pH-Wert (6.9-
7.1; Literaturvorgabe ist pH 6.9!!), die [ATP]-Basiskonzentration bzw. den [F-6P]-Konzentrationsbereich
(Messpunkte zwischen 1 und 20 µl an F-6P), falls das Phänomen sich mit
den Vorgaben nicht deutlich zeigt.
Vorschlag: Mit dem Pipettierplan kann aufgrund der zahlreichen kritischen Parameter nur
eine Anregung gegeben werden. Beginnen sie bei der höchsten F-6P-Konzentration, da hier
die Kinetik am wenigsten Probleme bereiten sollte. Dann F-6P Konzentration zunächst in
Zweierstufen senken, bis der problematische Bereich erreicht wird. Schließlich den
messbaren Bereich – insbesondere bei niedrigen F-6P Konzentrationen – so gut wie möglich
abdecken. Falls die Depletion zu lange dauert: Stammlösung anlegen und inkubieren, dann
vermessen und aliquotieren.
- können Sie das in Lehrbüchern häufig zitierte kooperative Verhalten der PFK
nachvollziehen?
- ergibt sich ein anderes Ergebnis, wenn Sie versuchen, Tangenten an den
wahren Ursprung (t = 0) anzulegen und dabei die "lag"-Phase bei Ihrer
Auswertung zu berücksichtigen?
Tangenten an diese Art Kinetik lassen sich im Prinzip (!) über Composit (Option
[S]ubstrat; [P]rogress curve) erzeugen, vergleiche auch Kapitel 9.2.2. Ein Beispiel-file
lässt sich über ṕrogkuŕ aufrufen
- diskutieren Sie Unterschiede, die aus beiden Tangentenverfahren (linearer Ast
bzw. Steigung der "lag"-Phase) resultieren und diskutieren Sie ggf. wie hier ein
kooperatives Phänomen zustande kommt.
Abb. 7.4 a: So weit kamen wir 2002 und 2004: im
unteren Konzentrationsbereich gibt es zu wenige
verlässliche Messpunkte, um eine Entscheidung
"kooperativ oder nicht" zu treffen.
Abb. 7.4 b: ...und so weit 2003: der untere
Konzentrationsbereich ist gut belegt und nur durch
kooperative Bindung zu erklären. Nahe der Sättigung
wären einige Messpunkte von Vorteil gewesen.
Angleichung in "Composit" (Adair) liefert:
Vmax = 7
K(1) = 1300
K(2) = 1.3.
7.5 Versuch D3: Pyruvatkinase, ein kooperatives Enzym (?):