Modulatoren der Hyaluronsäurematrix im Rahmen der extrinsischen ...

6.6 EGF ELISA
Material und Methoden
Der Überstand von Keratinozyten wurde 24 Stunden nach Stimulation abgenommen und
hieraus die EGF-Konzentration mit dem human EGF ELISA Kit (abcam, Cambridge, UK)
nach Angaben des Herstellers bestimmt. Zur Messung des EGF-Gehalts in den murinen
Hautproben wurden äquivalente Mengen unter Stickstoff in 2 ml Eppendorf-Gefäßen mit Hilfe
einer Schwingmühle (MM400, Retsch, Haan) zermörsert, anschließend in RIPA Puffer
(Appendix 6.1.7) bei 37°C für 30 Minuten lysiert und die EGF-Konzentration mit dem murine
EGF ELISA Kit (abcam, Cambridge, UK) gemessen.
Die Menge an EGF wurde als Verhältnis der EGF-Konzentration zur
Gesamtproteinkonzentration des Zellrasens bzw. der lysierten Probe berechnet.
6.7 [³H]-THYMIDIN-INKORPORATION ZUR BESTIMMUNG DER PROLIFERATION
Die Bestimmung der Proliferationsrate erfolgte durch Messung des [ 3 H]-Thymidin (Perkin
Elmer, Bodgau-Jügesheim)-Einbaus. Dermale Fibroblasten wurden in 24-Loch-Platten in
einer Dichte von 15.000 Zellen pro Loch ausgesät. Nach 24-stündiger Synchronisation der
Zellen in serumfreiem Medium erfolgte die 24-stündige Stimulation. Während der letzten 4-6
Stunden wurde pro Vertiefung 1µCi/ml [ 3 H]-markiertes Thymidin hinzugefügt.
Die Aufarbeitung erfolgte nach Absaugen des Überstandes zunächst durch zweimaliges
Waschen mit 1 ml kaltem 1x PBS. Die Inkorporation des [ 3 H]-Thymidins wurde durch Zugabe
von 500 µl Perchlorsäure für zwei Minuten gestoppt. Nach Absaugen der Perchlorsäure
erfolgte die Lyse der Zellen durch Zugabe von 0,1 M Natriumhydroxid-Lösung (300 µl/Loch)
unter ständiger Bewegung bei 37 °C für 15 min.
Ein Teil des des Lysats (30 µl) wurden für spätere Proteinbestimmungen (vergleiche
Abschnitt 5.8) bei -20°C gelagert. Das übrige Zelllysat wurde mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit
(Lumac LSC, Niederlande) versetzt und mittels eines beta-Counter (Beckmann Coulter,
Krefeld) 3 min. vermessen. Die erhaltenen counts per minute wurden anschließend auf die
Proteinmenge normalisiert.
6.8 PROTEINBESTIMMUNG
Die Bestimmung der Proteinmenge erfolgte anhand der Methode nach Bradford. Hierzu
wurde das Bradford-Reagenz 1:5 mit ddH2O verdünnt und mit einem Volumen von 200 µl in
eine 96-Loch-Platte pipettiert. Als Standard diente eine BSA-Eichreihe von 2 µg bis 12 µg
BSA. Nach Zugabe der Eichlösung und der jeweiligen Proben zum Bradford-Reagenz wurde
die Extinktion bei 595 nm mit einem ELISA-Reader (Bio-Rad, München, Deutschland)
ermittelt.
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