Modulatoren der Hyaluronsäurematrix im Rahmen der extrinsischen ...

6.17.2 PRODUKTION DER LENTIVIREN
Material und Methoden
Mit Hilfe des Lipofektions-Reagenz Fugene 6 ® (Roche, Mannheim) wurde der Transfer in die
Produktionszellinie HEK 293T durchgeführt. Zur besseren Stabilisierung der Lentiviren wurde
das Wachstumsmedium (DMEM) nach 16 Stunden gegen HEPES-gepuffertes
Spezialmedium (Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium) ausgewechselt. Am Folgetag
wurden die Lentiviren geerntet und unter Zugabe von Poly-L-Lysin aufkonzentriert [127].
6.17.3 INFEKTION DER ZELLEN
Die Zielzellen wurden mit einer MOI (multiplicity of infection) von 5 infiziert. Um die
Verschmelzung der Virushülle mit der Zellmembran zu verbessern, wurden 10 µg/ml
Protaminsulfat zugegeben. Am folgenden Tag wurde das Medium gewechselt. Nach einer
Wartezeit von einer Woche und mindestens drei Medienwechseln wurde die Ausschaltung
der Zielgene mittels qRT-PCR validiert.
6.18 STATISTISCHE AUSWERTUNG
Die Messdaten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) aus n unabhängigen
Experimenten dargestellt. Datensätze wurden mittels ungepaartem Student‘s-t-Test
verglichen, wenn nur zwei Gruppen von Daten getestet wurden. Um signifikante
Unterschiede zwischen drei und mehr Konditionen zu überprüfen, wurden die Daten mittels
One-Way Analysis of Variance (ANOVA) und nachfolgendem Bonferroni-Test für multiple
Vergleiche analysiert. Ein Signifikanzniveau von p≤0,05 wurde als statistisch signifikant
angesehen. Die statistische Auswertung erfolgte mit der GraphPad Prism ® -Software (Version
5.0, GraphPad Software, San Diego, USA).
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