Lebenslauf - Life Science Nord

Online-Beobachtung des Stoffwechsels von Mikroorganismen
im Schüttelkolben (P)
Monika Winkelhorst und Maria Widjaja, Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg,
Forschungsschwerpunkt Bioprozess- und Analysentechnik, Leitung: Prof. Dr.-Ing. Reiner Luttmann,
Lohbrügger Kirchstraße 65, 21033 Hamburg
Ziel
Gentechnisch veränderte Mikroorganismen, wie die Hefe Pichia pastoris, dienen in der Biotechnologie
zur Expression pharmakologischer Proteine.
Im Vordergrund dieser Arbeit steht die Optimierung einer Vorkulturstrategie, um die Qualität der
Mikroorganismen für die spätere Kultivierung im Bioreaktor sicher zu stellen. Bedeutende Stoffwechselumstellungen
der Organismen durch Sauerstoff- oder Substratmangel können während der
Vorkultur den nachfolgenden Produktionsprozess in Bezug auf die Produktbildung negativ beeinflussen.
Mit der Online-Beobachtung von Sauerstoff und Kohlendioxid in der Gasphase besteht die
Möglichkeit Veränderungen diesbezüglich frühzeitig zu erkennen und vorzubeugen.
Methode
Die Versuche wurden im Schüttelkolben mit Strombrecher und angeschlossener O2- und CO2-
Sensorik der Fa. Bluesens durchgeführt. Die photometrische Bestimmung der optischen Dichte
erfolgte in Einmalküvetten mit 1 cm Schichtdicke in einem Absorptionsmessbereich zwischen 0.2
und 0.7 bei 600 nm. Zur Ermittlung der Biotrockenmasse wurden 1.5 ml-Reaktionsgefäße beschriftet,
getrocknet und ausgewogen. 1 ml der zu bestimmenden Probe wurde in dem jeweiligen Reaktionsgefäß
zentrifugiert, der Überstand entnommen und das Pellet bei 80 °C für 48 h getrocknet.
Die Aufnahme des Vollgewichts und Differenzbildung mit dem Leergewicht ergab die Biotrockenmasse.
Zur Bestimmung von Glycerol stand eine HPLC, Hitachi Merck, mit Brechungsindex-
Detektor zur Verfügung.
Ergebnisse
In einem ersten Versuch konnte das exponentielle Wachstum der Zellen mit Hilfe der Abgasmessung
sehr deutlich aufgezeigt werden. Die Zunahme der Zellmasse, bestimmt durch die Optische
Dichte, verlief synchron zur Abnahme der Sauerstoffabgasmolenbruchs und der Zunahme des
Kohlenstoffdioxidmolenbruchs. Im Laufe des Experiments kam es zu einer Veränderung dahingehend,
dass die Gasmolenbrüche entgegengesetzt des zu erwartenden Trends verliefen. Dies führte
im ersten Moment zu der Annahme, dass das Substrat aufgebraucht war. Die andauernde Zunahme
der OD und die anschließende Offline-Analyse der Substratkonzentration widerlegten dies jedoch.
In einem zweiten Versuch wurde, zusätzlich zu den bereits erwähnten Messgrößen, der pH-Wert
kontrolliert. Dadurch konnte die Ursache für die Veränderung in den Abgasmolenbrüchen gefunden
werden. Der pH-Wert des Mediums sinkt während der Kultivierung kontinuierlich bis in den stark
saueren Bereich von pH = 2. Ab da wurde der verringerte Sauerstoffbedarf und Kohlenstoffdioxidausstoß
beobachtet. Generell ist zu sagen, dass durch die Messung der Gaszusammensetzung im
Schüttelkolben das Wachstum sehr gut beobachtet und ein optimaler Zeitpunkt zum Überimpfen
der Kultur in den Bioreaktor gefunden werden kann.
Schlussfolgerung
Durch die Messung der O2- und CO2-Molenbrüche mit Online Sensoren der Firma BlueSens kann
der optimale Überimpfzeitpunkt ohne weitere Offline-Analytik ermittelt werden.
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