Lehrstuhl für Mikrobiologie - Helmholtz Zentrum München

MATERIAL UND METHODEN
B.1.9.: Transformation von Mikroorganismen
B.1.9.1.: Transformation von Escherichia coli
In der vorliegenden Arbeit wurden die Klonierungskits TA Cloning � Kit und TOPO-TA
Cloning � Kit zur Klonierung von PCR Fragmenten verwendet (in vitro gen, Carlsbad, USA).
Die Vektorsysteme pCR 2.1 und TOPO-pCR 2.1 wurden für die Transformation von E. coli
INVαF´ Zellen verwendet. Alle für die Transformation benötigten Lösungen und die
kompetenten Zellen mit Ausnahme des verfestigten LB-Mediums waren im Klonierungskit
enthalten. Die Ligation, Transformation und die Identifizierung rekombinanter Klone erfolgte
nach Angaben des Herstellers.
B.1.9.2.: Transformation von Listeria monocytogenes
Mit einer ÜN Kultur der jeweiligen Listeria Kultur wurden 50 ml BHI Medium 1:25 beimpft.
Dieser Ansatz wurde bis Anfang der logarithmischen Wachstumsphase aerob auf dem
Rundschüttler (180-200 rpm) inkubiert. Nach Zugabe von 25 µl Penicillin-G-Lösung (5
mg/ml) wurde die Kultur weiter bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase inkubiert.
Die Zellen wurden geerntet (5.000 x g, 4°C) und anschließend 2 x mit 3,5 x SMHEM
Medium [B.1.3.1.] gewaschen, anschließend in 500 µl 3,5 x SMHEM Medium gründlich
resuspendiert und zu 250 µl aliquotiert. Diese kompetenten Listeria Zellen wurden entweder
sofort elektrotransformiert oder bei –80°C gelagert. In der vorliegenden Arbeit wurden
Listeria Zellen mit den Plasmiden pactA-GFP und psod-GFP (Bubert et al., 1999)
transformiert. Dazu wurden zu den auf Eis gestellten kompetenten Zellen 5 µl des jeweiligen
Plasmids pipettiert. Dieser Ansatz wurde in eine gekühlte und trockene
Elektroporationsküvette (EquiBio, Boughton Monchelsea, Kent, UK, Elektrodenabstand 2
mm) überführt. Nach Elektroporation der Plasmide (100 Ω, 2,25 kV, 25 µF) für 3 s wurde der
gesamte Ansatz mit 2 x 500 µl sterilem BHI Medium in ein steriles ERG überführt. Die
phänotypische Expression erfolgte durch 3 h Inkubation bei 37°C. Jeweils 180 µl wurden
daraufhin auf BHI Tet, 7,5 -Medium ausplattiert und bis zu 2 Tage bei 37°C aerob bebrütet.
Einzelne Kolonien wurden gepickt und auf das Vorhandensein des Plasmids hin überprüft
[B.1.5.4.].
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