林雅萱

生化科技學系微生物與細胞專題討論
題目: Fas signaling promotes motility and metastasis through epithelial-mesenchymal
transition in gastrointestinal cancer
作者: HX Zheng, YD Wang, XB Cui, TT Xie, WJ Li, L Peng, Y Zhang, ZQ Wang,
J Wang and B Jiang
文章來源: Oncogene. dio:10.1038/onc.2012.126 (advance online publication)
演講人: Ya-Hsuan Lin 林雅萱
指導老師: Chin-Tin Chen, Ph.D. 陳進庭 博士
演講日期: December 11, 2012
演講地點: The 6 th Classroom
摘要
目前科學研究發現,Fas (APO-1/CD95)訊息傳遞(Fas signaling)除了會引發細
胞凋亡(cell apoptosis)以外,也具促進腫瘤移動(motility)能力,這可能是藉由 Fas
的訊息傳導而誘發 epithelial-mesenchymal transition (EMT)使腫瘤發生癌轉移
(metastasis);本研究證實在人類胃腸癌細胞株中 Fas 訊息傳遞會抑制上皮細胞的
標記分子(epithelial marker)表現及提升間質細胞(mesenchymal marker)表現,並促
使癌細胞移動,利用 Fas Ligand (FasL)處理後其癌細胞型態也會和間質細胞型態
類似,以上結果都與 EMT 的現象相印證;另外研究發現 Fas 訊息同時使 ERK1/2
活化也會影響 EMT 的發生與否。活體組織切片結果顯示在活體內(in vivo) Fas 訊
息和 EMT 發生皆和腫瘤發展有關。常見抗癌藥物 oxaliplatin 所引發 EMT 使癌轉
移能力上升,部分也是受 Fas 訊息傳遞影響;最後研究證實,無論活體外或活體
內 Fas 的訊息傳遞均能引發 EMT 促使癌細胞活化與轉移能力提升。
本研究之重要性
前言
胃腸道癌症(Gastrointestinal cancer)是常見的原發性腫瘤,為主要癌症的死因
之一,且發生癌轉移的現象也相當普遍,在胃腸道癌症發展後期會對化療藥物產
生抗藥性,其中許多化療藥物是藉由提高 Fas 與 FasL 的表現量引發細胞凋亡的
機制,然而,此機制是否有可能使腫瘤細胞產生抗藥性,導致腫瘤不受 Fas 訊息
引發細胞凋亡的機制調控甚至是誘導癌症轉移是有待評估的,研究數據顯示,約
26%的結腸癌病患經過化療後會發生癌轉移使腫瘤擴散;有鑑於此,Fas 訊息傳
導其對於細胞凋亡以及癌轉移中間的調控機制應被進一步釐清,以評估各種治療
方法對於癌症的適切性。
前人做過的研究
Fas 藉著與 Fas Ligand (FasL)結合後活化凋亡蛋白酶(caspase)的訊息傳遞鍊
使細胞凋亡,此外,Fas 和 FasL 的結合會產生其他非走向細胞凋亡(non-apoptotic)

的影響如調控細胞週期、肝臟再生、cytokine 與 chemokine 表現、腫瘤生長、抗
細胞凋亡(apoptosis-resistant)癌細胞的癌轉移與侵襲[1] 、調控其他細胞訊息傳導
物質如 NFκB, MAPK,及 PI3K/AKT 等,而調控細胞走向細胞凋亡是依據 Fas 訊
息傳遞的刺激強度[2]。
EMT 主要是細胞與基質間的交互作用,使細胞表現型態發生轉移,由上皮
細胞態轉化成間質細胞態[3];在腫瘤後期發展中發現上皮細胞的標記分子
(marker)表現量相對較低,而間質細胞的標記分子表現量相對較高,顯示 EMT
有可能參與癌轉移的病程中。目前的研究中發現,老鼠的結腸癌細胞中 Fas 訊息
可能是藉由 EMT 作用機制引發癌細胞轉移,然而該途徑是否也同樣發生於人類
癌症轉移的作用之中需要進一步討論。
作者為何要做本研究
作者將上述於老鼠細胞中所知的癌轉移路徑提出假設,在人類的胃腸癌細胞
株以及活體內是否循相同路徑發生癌轉移,藉著調控 Fas 訊息活化的強度觀察不
同細胞株所產生不同的細胞現象,降低 Fas 或 FasL 表現觀察 EMT 是否發生,分
析活體內組織切片的 EMT 標記分子與癌症進展關聯,以及化療藥物 oxaliplatin
引發 EMT 是否與 Fas 訊息傳遞進行評估。
本研究欲完成之項目
藉人類胃腸癌細胞及活體組織切片探討在 Fas 訊息活化機制引起 EMT 導致
癌轉移能力上升的可能,以及 oxaliplatin 是否藉此途徑引起 EMT 導致癌症轉移。
細胞培養
材料與方法
所使用的胃腸癌細胞培養於含 100 IU/ml penicillin, 10% fetal bovine
serum(FBS)的 RPMI 1640。
細胞轉染
使用 lentiviral shRNA vectors 各別表達 human Snail, Twist, Fas and FasL 後送
入胃腸癌細胞長期抑制目標基因表現,以 10 μg/ml puromycin 進行篩選。
胃腸組織切片觀察
由南方醫院提供尚未經過治療的病人檢體進行石蠟包埋切片,病理診斷與分
類是根據國際聯合抗癌組織(UICC)標準。
免疫組織化學染色(immunohistochemistry,IHC)
經石蠟包埋的切片以 10% non-immune goat serum 進行 blocking 防止二抗非
專一性吸附,隨後以 Anti-FasL 及 E-cadherin 一抗結合,中間以 PBST 洗滌,
3,3’-Diaminobenzidine 呈色。病理師在未知樣本編號下進行計分法。
西方墨點法
由 RIPA lysis buffer (with protease and phosphatase inhibitor)抽取全蛋白質,
BCA 方法定量後以 4-20% SDS polyacrylamide gel 進行電泳再轉印到硝化纖維膜
上,加入抗體結合呈色以 ECL 進行偵測。

RT-PCR
以 Trizol 抽取全部 RNA,2 μg RNA product 進行反轉錄合成 cDNA,用 1 μl
cDNA 進行 PCR,最後以 1.5%洋菜膠進行電泳以 Ethidium bromide 染色呈色。
流式細胞儀分析
收集細胞後以含 2% BSA 的 PBS 重新懸浮,於 4℃ 添加 Fas-PE 或 FasL-PE
反應 30 分鐘,以 PBS 洗滌兩次後上機進行分析。以老鼠的 IgG-PE 做為負對照
組,另加入 MMP (matrix metalloproteinases)抑制劑預防 marker 被截切。
癌細胞轉移與遷徙分析
利用 invasion chamber 進行分析,上層種細胞並在不含血清培養液培養,下
層加入含 10%血清培養液,培養 72 小時候下層以 4% paraformaldehyde 固定並
DAPI 染色,再以螢光顯微鏡進行細胞計數。
免疫螢光染色分析
細胞以 4% paraformaldehyde 固定,5% FBS in PBS blocking 避免非專一性結
合,陸續加入一抗與二抗接合後封片,以螢光顯微鏡觀察分析。
ELISA
由細胞外泌 MMP9 和 MMP2 ( por- and acive-form)於上清液中以 Human
Quantikine ELISA kit 進行偵測,並以對照組做為基準比較相對量的分析。
結果與討論
胃腸癌細胞株中 Fas 與 FasL 的表現量
比較各種不同胃腸癌細胞株其本身 Fas 及 FasL 表現量差異,發現有 Fas 表
現量且 FasL 表現量低於偵測值的細胞株有 SW480, DLD1, AGS,其細胞型態則
與上皮細胞相似;而 FasL 表現量高而有相對低量的 Fas 表現的細胞株為 SW620,
其細胞型態與間質細胞相似。由圖(一)可見,不同劑量 FasL 處理 SW480, DLD1,
AGS 對細胞凋亡的效果也不同,顯示低劑量的 FasL 結合所產生的影響有可能是
非細胞凋亡的調控路徑;而以 FasL 抑制劑 NOK-1 處理 SW620 並不會對細胞生
長造成影響。
Fas 訊息傳遞提升胃腸癌細胞的癌轉移能力
以低劑量 FasL(12.5 ng/ml)處理 SW480, DLD1, AGS 後觀察其癌轉移能力如
圖(二),發現處理後的細胞株其轉移能力顯著提升,另以 shRNA 抑制 Fas 表現後
再加入 FasL,其轉移能力不再有顯著上升;分別以 NOK-1 處理及 shRNA 抑制
FasL 表現後 SW620 其癌轉移能力均有下降趨勢。在活體內所能遇到的 FasL 具
有兩個型態─溶於血清中的 soluble FasL(sFasL)以及膜上的 membrane-bound
FasL(mFasL),本實驗利用 DLD1 與 AGS 細胞株分別培養於會表現 mFasL 的
SW620 細胞株上進行實驗分析,證實活體中 mFasL 同樣可以如 sFasL 一樣提升
癌轉移能力,而加入 NOK-1 後轉移能力與控制組無明顯差異表示並不是兩種細
胞藉其他的 cytokine 訊息傳遞影響癌轉移能力。
Fas 訊息傳遞引發 EMT 使胃腸癌細胞轉移活化

EMT 藉由降低上皮細胞的標記分子(epithelial marker)及提高間質細胞的標
記分子(mesenchymal marker)來提升腫瘤細胞的轉移能力,本實驗利用 RT-PCR
以及西方墨點法顯示於圖(三)及圖(四),Fas 訊息傳遞會降低上皮細胞的標記分子
E-cadherin, Villin 和 Occludin 表現量,並增加間質細胞的標記分子 Vimentin 及
Snail 的表現量,若抑制 Fas 表現則不會有 EMT 的現象發生;在 SW620 以 NOK-1
或 shRNA 抑制 FasL 表現量時則上皮細胞的標記分子表現上升而間質細胞的標記
分子表現下降;研究亦分析癌轉移相關蛋白質酵素 matrix metalloproteinase
(MMP9 與 MMP2)發現,FasL 處理後細胞的上清液中發現兩種蛋白酶表現均有明
顯的提升。
為了確定 FasL 訊息是透過哪些轉錄因子調控 EMT 並導致癌細胞轉移,將
Snail 與 Twist 以 shRNA 抑制後發現如圖(五),FasL 處理無法增加兩者相對於
shRNA 處理後的表現量,且癌細胞轉移的程度也相對下降;在受 shRNA 抑制情
形下對照發限,FasL 處理後轉移能力又明顯比未處理高,表示 Fas 誘導 EMT 增
強胃腸癌細胞轉移能力的應需要藉其他轉錄因子調控。
Fas 活化 ERK1/2 誘導 EMT 以及胃腸癌細胞轉移能力
Fas 訊息傳遞亦可引發其他細胞訊息路徑,研究指出在 FasL 處理後訊息傳
遞分子 ERK1/2 會被活化,而另以 U0126 處理抑制 ERK1/2 活性時,Fas 引發的
EMT 以及癌細胞轉移同樣也被抑制如圖(六)。
化療藥物 Oxaliplatin 於大腸癌細胞引發的 EMT 部分是受 Fas 訊息誘導
部分化療藥物是藉提高 Fas 和 FasL 使癌細胞凋亡而達到療效,然而某些病
患在治療後腫瘤反而持續生長並出現病灶轉移的現象,由 Oxaliplatin 測試癌細胞
株所見圖(七),在增加 Fas 及 FasL 表現同時 EMT 代表的標記分子表現如前述發
生表現量的轉變,以 NOK-1 處理只能部分抑制 oxaliplatin 誘導的 EMT,顯示其
中僅有少部分是藉 Fas 訊息誘導,且該藥物可在 Fas shRNA 表現後的 SW480 引
發 EMT,表示 oxaliplatin 可藉由其他調控路徑引發 EMT。
Fas 在體內亦會引發 EMT 以及提升癌轉移能力
利用病人檢體以 IHC 處理觀察如圖(八),FasL 表現上升而 E-cadherin 表現下
降,呈現高度負相關的關係;依統計分析後,將 Fas(-/+)/E-cadherin(++/+++)做為
無 EMT 表型(non-EMT phenotype)的樣本及 Fas(++/+++)/E-cadherin(-/+)為有 EMT
表型(EMP phenotype)的樣本進行觀察發現,EMT 樣本大部分被病理學家計入後
期癌症發展階段[圖(八)c];且 EMT 表型和無 EMT 表型在預後癌症發展的階段上
有明顯的差異。
參考文獻
[1] Curtin JF, Cotter TG. Live and let die: regulatory mechanisms in Fas-mediated
apoptosis. Cell Signal, 2003; 15: 983–992.
[2] Lavrik IN, Golks A, Riess D, Bentele M, Eils R, Krammer PH. Analysis of CD95
threshold signaling. J Biol Chem, 2007; 282: 13664–13671.

[3] Przybylo JA, Radisky DC. Matrix metalloproteinase-induced epithelial
mesenchymal transition: tumor progression at Snail’s pace. Int J Biochem Cell Biol,
2007; 39: 1082–1088.
圖表
圖(一) (A)SW480(B)DLD1(C)AGS 在不同 FasL 劑量處理後觀察細胞存活的比率;
(D)SW620 加入 NOK-1 對細胞生長的影響。

圖(二)(a)SW480(b)DLD1 分別以 NOK-1 處理(N)、NOK-1 處理再加入 sFasL(N+L)、sFasL
處理(L)及對照組;(c)SW480(d)DLD1 分別以對照組(C)、Fas shRNA expressing
construct(F)、sFasL(L)加入及混合處理;(e)SW620 以不同條件處理,(FL)為 FasL shRNA
expressing construct;(f)DLD1 加入 SW620(SW)以及 NOK-1 處理。

圖(三) (a)SW480(b)DLD1 加入 FasL 後在不同時間點(d as days)分析各相關標記分子表現
量差異。(c)SW620 加入 NOK-1 後在不同時間點分析各標記分子表現量。(d)MMPs 的
表現量變化。

圖(四)(a)以 FasL 處理三天後以免疫螢光染色分析觀察各分子的表現差異(紅色)。(b)為
FasL 處理三天後細胞型態上的轉變。

圖(五)以 shRNA 分別抑制 Twist 及 Snail 表現觀察其對 FasL 處理後表現差異及轉移能力
影響。
圖(六)(a)FasL 處理後在不同時間點觀察蛋白質表現。(b)以不同方式處理觀察標記分子
表現。(c)抑制 ERK1/2 活性後以 FasL 處理觀察轉移能力的影響。(d)以螢光顯微鏡觀察
標記分子在不同處理的狀況

圖(七)(a)(b)以 Oxaliplatin(Oxa)處理三天(3d)Fas 與 FasL 表現。(c)(d)加入 NOK-1 觀察
EMT 標記分子表現量改變。(e)Fas shRNA(F)處理後標記分子的表現量差異。
圖(八)(a)IHC 分析隨著癌症進展 FasL 和標記分子表現變化。(b)FasL 和 E-cadherin 表現
相關程度。(c)隨癌症發展觀察 EMT 表型差異。(d)不能癌症發展期(A,D)其 EMT 標記分
子的表現量(e)(f)由 EMT 表現型態觀察病患癌症發展方向。