ABI real-time PCR技术讲座(.pdf)

荧 光 PCR 原 理 及 应 用
周 煜 ZHOU Yu
Application Specialist
cnmcbsupport@appliedbiosystems.com

ABI 公 司 及 其 荧 光 PCR 仪 器

美 国 ABI 公 司 荧 光 定 量 PCR 仪 发 展 历 史
1995- 世 界 上 第 一 台 定 量 PCR 仪 7700 型
1997- 向 医 院 用 户 推 出 5700 型 定 量 PCR 仪
2000- 推 出 7900 型 384 孔 荧 光 定 量 PCR 仪
} 公 认 最 高 端 定 量 PCR 仪
2001- 7900 型 96 孔 荧 光 定 量 PCR 仪
2001- 推 出 7000 型 荧 光 定 量 PCR 仪 取 得 巨 大 成 功
2003- 获 得 了 荧 光 定 量 PCR 仪 专 利 - 确 立 ABI 在 业 界 内 的 独 特 地 位
2004- 第 3 代 荧 光 定 量 PCR 仪 7300 和 7500 型
2007- 第 4 代 荧 光 定 量 PCR 仪 StepOne 和 StepOnePlus
3

ABI 公 司 荧 光 PCR 仪 器
4

ABI 公 司 荧 光 PCR 仪 器
Applied Biosystems 7900HT Fast
Real-Time PCR System
Applied Biosystems 7500 Fast
Real-Time PCR System
Applied Biosystems StepOne
Real-Time PCR System
Applied Biosystems 7500
Real-Time PCR System
Applied Biosystems 7300
Real-Time PCR System
5

各 种 荧 光 PCR 仪 器
6

荧 光 PCR 的 化 学

两 种 荧 光 化 学 原 理
●
Fluorogenic 5’ Nuclease Assay
– An established and proven chemistry for high specificity nucleic
acid real-time quantitation
– The introduction of TaqMan® MGB (Minor Groove Binder) probes
has produced a turn-key homogeneous chemistry for the detection
of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
●
SYBR® Green 1 Double Stranded DNA Binding Dye Assay
– Ideal for target identification (screening) assays
– A lower-cost alternative when high specificity is not required
8

TaqMan 探 针
5’ 3’
5’ 3’
3’
5’
Excitation
Excitation R
Q Q
R
R
3’
5’
9

TaqMan MGB 探 针
R
(non-fluorescent quencher) NFQ
Q
AGGCCTTGAGAGATAT
Q
MGB
(minor groove binder)
提 高 探 针 Tm 值
R
AGGCCTTGAGAGATAT Q
| | | | | | | | | | | | | | | |
GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
R 报 告 荧 光 NFQ 无 荧 光 淬 灭 基 团 MGB 小 沟 结 合 物
10

MGB 探 针 的 优 点
●
●
●
●
提 高 淬 灭 效 率
减 少 背 景 、 提 高 信 噪 比
提 高 探 针 Tm 值
– 长 15 碱 基 , 提 高 18°C
缩 短 探 针 长 度
– 最 佳 范 围 13-21 碱 基
11

TaqMan MGB 探 针 鉴 别 等 位 基 因
FAM
MGB
NFQ
Q
R
5′ 3′
MGB
分 辨 1 个 碱 基 的 精 确 度
完 全 配 对 , 有 信 号
FAM
MGB
一 个 碱 基 不 配 对 , 没 有 信 号
12

SYBR Green 染 料
SYBR Green I 与 dsDNA 结 合
与 DNA 结 合 时
游 离 时 光
13

融 解 曲 线 (Dissociation curve)
●
●
●
Easily check for specificity of your SYBR assays
immediately after PCR
Thermal conditions (after last cycle of PCR):
– Hold at 95°C for 20 sec
– Hold at 60°C for 20 sec
– Ramp and collect fluorescent data to 95°C over course of
20 minutes
Software automatically generates melt curve profiles
14

融 解 曲 线 (Dissociation curve)
原 始 图 谱
导 数 图 谱
15

高 分 辨 溶 解 曲 线 (HRM, High Resolution Melting )
●
Different from a regular SYBR ® Green dye melt curve:
– Chemistry: Saturating and brighter dsDNA binding dyes
• LCGreen ® EvaGreen TM SYTO ® 9
– Instrument: More data points are collected
– Software: New fluorescent normalization algorithms and
plots
16

Now can be performed on the ABI 7500 Fast System
●
●
The analysis is based on the difference in curve shape as well as Tm.
HRM can identify mutations that cause Tm changes as minor as
0.1°C.
17

染 料 法 的 特 点
●
成 本 低
●
兼 容 熔 解 曲 线
●
特 异 性 问 题
●
不 能 进 行 多 重 扩 增
18

荧 光 PCR 的 防 污 染 技 术
Uracil N-glycosylase
Chemical method to destroy
contaminating
amplicons.
U
U
All amplification
chemistries use dUTP.
U
U
UNG does not function
above 55 o C
19

荧 光 参 比 - Passive Reference Dye: ROX
ROX 以 固 定 的 浓 度 配 在 Master Mix 中 , 不 参 与 PCR 扩 增
ROX 的 功 能 :
Improves precision.
Compensates for small fluorescent fluctuations that can occur from well-to-well
Can be useful for diagnosing troubles
Rn = Normalization = Reporter / Reference
Reporter
Reference
20

ROX Normalizer
36 Replicates analyzed
with ROX passive
reference dye
36 Replicates analyzed
without ROX passive
reference dye
21

定 量 PCR 的 数 学 原 理

实 时 定 量 与 终 点 定 量
终 点 处 产 物 量 不 恒 定
Ct 值 则 极 具 重 现 性 !
23

PCR 动 力 学 曲 线 和 四 个 阶 段
线 性 图 谱
平 台 期
线 性 增 长 期
指 数 增 长 期
基 线 期
平 台 期
线 性 增 长 期
指 数 增 长 期
基 线 期
对 数 图 谱
24

什 么 是 CT 值 ?
荧 光 信 号 穿 过 阈 值 线 时 的 循 环 次 数 -threshold cycle
线 性 图 谱
对 数 图 谱
C T 值
C T 值
25

PCR 扩 增 的 数 学 模 型
● 扩 增 产 物 的 总 数 量 可 以 下 式 表 示 :
Y n
=X·(1+E) n
Y n
为 PCR 产 物 的 分 子 数 量
n 为 周 期 数
E 为 扩 增 效 率 (0

斜 率 与 截 距
●
CT = - k lgX0 + b
– Slope=-1/log(1+E)
• If E=1, Slope= -3.3219280……
• Normally, slope is about -3.5~-4.2
– Intercept
• Normally, intercept is about 30~40
27

C T 值 对 [DNA] 0 作 图
C T 值
C T = - k lgX 0 + b
lg [ 起 始 DNA]
28

成 功 的 定 量 PCR 数 据
29

实 时 荧 光 PCR 技 术 的 主 要 优 点
● 可 进 行 定 量 PCR 检 测 , 定 量 范 围 (Dynamic Range) 宽 ;
● 操 作 方 便 - 无 复 杂 的 PCR 后 分 析 步 骤 ;
● 全 封 闭 式 检 测 - 减 少 污 染 ;
● 检 测 灵 敏 度 及 特 异 性 高 ;
● 多 通 道 分 析 ;
● 熔 点 曲 线 分 析 (Dissociation curve)……
30

荧 光 PCR 技 术 的 应 用

主 要 应 用
Real time
Quantitative PCR
End point
Plus/minus Assays
+ + - +
Allele Discrimination
32

定 量 PCR - Quantitative PCR
●
How many?
– 绝 对 定 量 Absolute Quantitation
●
How much?
– 相 对 定 量 Relative Quantitation
33

Results from RNase P Instrument Verification Plate
●
Standard curve amplifications
● showing 20K, 10K, 5K, 2.5K
●
●
and 1.25K copy populations
in replicates of four
●
●
“Unknown” amplifications
showing 10K and 5K copy
● populations in replicates of 36
34

Results from RNase P Instrument Verification Plate
35

Calculating DNA Quantity of a Sample
36
34
y = -1.2908Ln(x) + 27.187
R 2 = 0.997
32
Sample
30
C T
28
26
24
22
20
0.001 0.010 0.100 1.000 10.000 100.000
(Log N) initial concentration
36

Data Report Table
37

Dynamic Range Data
Amplification of
serial dilutions of
IL-10 target in
replicates of 8
Standard curve
showing 7 logs
of linear dynamic
range
38

相 对 定 量
●
Relative gene expression:
– Compare treated samples vs. untreated samples (calibrator
samples)
– RNAi validation
– Array validation
39

相 对 定 量
●
ΔΔCt
– 相 对 量 = 2 -ΔΔCT
– 目 标 序 列 和 内 参 序 列 的 扩 增 效 率 相 等 ( 且 接 近 100%)
●
The Relative Standard Curve Method
40

Relative Expression
41

等 位 基 因 分 析
Allelic Discrimination (SNP Detection)
42

等 位 基 因 鉴 定 机 理
野 生 型
(wt)
突 变 型
(mut)
43

TaqMan ® MGB 探 针
●
Minor Groove Binder enhances the melting temperature
(Tm) of the probe resulting in shorter probes
– Shorter probes provide better discrimination
– TaqMan® MGB probes provide excellent discrimination
even with A/T rich sequences
44

Allelic Discrimination Assay
FAM
VIC
VIC
FAM
FAM
VIC
Homozygote for
FAM-specific allele
Homozygote for
VIC-specific allele
Heterozygote for
both alleles
45

Allelic Discrimination Dye Components Viewer
FAM
VIC
46

阴 阳 性 鉴 定
Plus/Minus Assay
47

Plus/Minus Calls = Automatic Results
Pathogen
Internal Positive Control
+ - = Yes
- -
= No Amp
- +
= No
+ +
= Yes
48

Target vs. IPC Competition
Target
IPC
49

荧 光 PCR 光 学 原 理

需 要 了 解 的 问 题
●
●
●
荧 光 染 料
激 发
– 光 源
– 波 长
检 测 器
– 原 件
– 波 长
51

7500 System Common Hardware Features - Lamp
●
New Tungsten Halogen Excitation Lamp
– Rated to 2,000 hours
– Instrument has lamp life monitoring capability and notifies
user when change is required or estimated lifetime is
exceeded
– User changeable
52

7500 System Hardware Features - Optical
●
●
●
●
5 Excitation Filters
5 Emission Filters
Filters are optimized to excite a broader range of dyes
– FAM, SYBR® Green I
– VIC, JOE
– NED,TAMRA, CY3 Dye.
– ROX (passive reference), Texas Red®
– CY5 Dye
Multicomponenting algorithm means that we don’t require new filters
to add new custom dyes
53

配 套 试 剂
●
●
●
●
●
●
●
TaqMan ® Master Mix
TaqMan ® Gene Expression Master Mix
TaqMan ® SNP Genotyping Master Mix
Fast SYBR ® Green Master Mix
TaqMan ® Gene Expression Assays
TaqMan ® SNP Genotyping Assays
Custom Primers & Probes
54

定 量 PCR 的 实 验 要 素

定 量 PCR 实 验 要 素
● 目 标 基 因 样 品
● 标 准 曲 线 标 准 品
● 监 控 系 统 故 障 阳 性 对 照
● 监 控 污 染 阴 性 对 照
● 校 准 生 物 学 误 差 阳 性 内 对 照 (IPC)
● 校 准 物 理 误 差 参 比 荧 光 (ROX)
● 降 低 其 余 误 差 重 复 实 验
56

样 品
●
●
DNA 纯 度 :OD260/OD280=1.8,1.6 ~ 2.0 之 间
DNA 用 量 :0.05 ng – 100 ng
●
●
RNA 纯 度 :OD260/OD280=2.0
cDNA 用 量 :1-100 ng 总 RNA 反 转 录 的 cDNA 取 1 uL
57

标 准 品
●
目 的 : 生 成 标 准 曲 线 , 建 立 CT 值 与 浓 度 之 间 的 线 性 关 系
● 要 求 :
– 浓 度 已 知
– 5 点 以 上
– 标 准 品 与 待 测 样 品 的 PCR 效 率 一 致 , 且 接 近 100%
• 仪 器 质 量 一 致
• 试 剂 质 量 一 致 : 模 板 纯 度 、 引 物 和 探 针 的 Tm 值 、 酶 活 性 、 缓 冲 液 成 分
• 反 应 条 件 一 致 : 循 环 参 数 相 同 、 同 一 次 实 验
● 不 要 求 :
– 不 要 求 标 准 品 与 目 标 基 因 使 用 相 同 的 DNA
– 可 以 相 同 , 也 可 以 不 同
C T = - k lgX 0 + b
58

标 准 品 梯 度 稀 释 方 法
●
●
选 择 目 标 → 提 取 /PCR → 纯 化 → 测 定 浓 度 → 调 整 浓 度 → 梯 度
稀 释
CT 值 在 18-30 之 间 , 覆 盖 全 部 样 品 浓 度 区 间
● 10 倍 连 续 梯 度 稀 释 方 法 :
– 1v 原 液 ( 标 准 品 i) +9v 稀 释 缓 冲 液 , 得 标 准 品 ii
– 1v 标 准 品 ii+9v 稀 释 缓 冲 液 , 得 标 准 品 iii
– 1v 标 准 品 iii +9v 稀 释 缓 冲 液 , 得 标 准 品 iv
– 1v 标 准 品 iv +9v 稀 释 缓 冲 液 , 得 标 准 品 v
– 切 不 可 由 标 准 品 i 分 别 加 不 同 体 积 的 稀 释 缓 冲 液 直 接 得 到 标 准
品 ii、iii、iv、v
59

标 准 品 单 位
●
标 准 品 的 单 位
●
根 据 最 终 目 的 选 择 标 准 品 单 位
– 如 果 要 求 测 定 样 品 的 基 因 拷 贝 数 , 则 梯 度 稀 释 已 知 摩 尔 浓 度 的 DNA
片 段
– 如 果 要 求 测 定 样 品 的 重 量 百 分 比 [%(w/w)], 如 转 基 因 , 标 准 品 是 将
转 基 因 与 非 转 基 因 食 品 粉 末 按 重 量 比 混 合 , 然 后 抽 提 混 合 DNA; 切
不 可 先 抽 好 转 基 因 DNA, 再 梯 度 稀 释 , 也 不 可 分 别 抽 提 转 基 因 与 非
转 基 因 DNA, 再 按 重 量 比 例 混 合 ( 这 样 得 出 的 是 基 因 重 量 百 分 比 ,
而 不 是 样 品 重 量 百 分 比 )
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PCR 效 率 对 定 量 结 果 的 影 响
n = 30
1+Ex = 1.95
N = N 0 1.95 30 = N 0 x 5.0 x 10 8
相 差 2.2 倍
n = 30
1+Ex = 1.90
N = N 0 1.90 30 = N 0 x 2.3 x 10 8
(Ex= 扩 增 效 率 ;n= 循 环 圈 数 ;No= 起 始 模 板 分 子 数 ;N= 扩 增 产 物 分 子 数 )
61

PCR 效 率 测 定
K=-1/log(1+Ex)
62

???
●
在 使 用 TaqMan MGB 探 针 的 情 况 下 , 你 认 为 管 家 基 因 与 目
标 基 因 是 在 同 一 管 内 做 多 重 定 量 好 , 还 是 分 成 两 管 分 别 定
量 好 ? 哪 一 种 检 测 的 数 据 更 精 确 ?
63

ROX 校 准 增 加 数 据 精 度
64

复 管 测 试
●
●
样 品 和 标 准 品 都 要 重 复
重 复 次 数 须 遵 循 统 计 学 要 求
65

误 差 的 校 正
●
生 物 学 方 面 的 误 差 :IC 校 正
– 细 胞 数 量 的 差 异 、 抽 提 效 率 、 纯 化 损 失 、 反 转 录 效 率 等
●
物 理 方 面 的 误 差 :ROX 校 正
– 枪 的 误 差 ( 如 试 剂 体 积 )、 耗 材 质 量 ( 如 管 盖 厚 度 、 透 光 性 能 不 一
致 ) 所 导 致 的 光 能 损 失 、 仪 器 稳 定 性 ( 如 孔 间 、 批 间 温 度 的 波 动 )
的 误 差 等
●
其 余 的 误 差 : 统 计 校 正
– 重 复 实 验 , 取 平 均 值
66

Q & A
67

术 → 道
☯ 生 物 学 意 义 ☯
检 测 技 术
68

谢 谢 !
8008203939
cnmcbsupport@appliedbiosystems.com