MICROBIOLOGIA GENERAL Guia de Trabajos Prácticos

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TP Nº 5PRUEBAS BIOQUÍMICASLa utilización de medios selectivos y diferenciales, las tinciones de Gram, características de las colonias ymotilidad en el estudio de una determinada bacteria nos brinda una gran información sobre el génerobacteriano con el que se está trabajando.Una vez aislada una bacteria determinada, se le pueden realizar una serie de pruebas que evalúan suactividad bioquímica. Esto permite hacer una identificación final de la especie en cuestión, es decir seestudian ciertos sistemas enzimáticos que son únicos de cada especie y que sirven como marcadodres deidentificación.En el laboratorio, esos sistemas enzimáticos se detectan inoculando la colonia bacteriana bien aislada yfresca (24-48 hs de crecimiento) en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos específicos eindicadores químicos para detectar cambios de pH o presencia de subprocuctos específicos.Objetivos: a) Identificar distintas especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. b)Diferenciar distintas especies de Pseudomonas. c) La diferenciación entre Estafilococos y Estreptococos.Desarrollo:Se someterán cultivos (de 24-48 hs), de las distintas colonias aisladas a distintas pruebas bioquímicas1) Prueba de la OxidasaEsta prueba sirve para detreminar la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones demicroorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus,Staphylococcus y Micrococcus (-) de Pseudomonas y Aeromonas (+).Se debe partir de cultivos puros de bacterias crecidos en agar nutritivo 18-24 hMetodología:A) Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.B) Aplicar la colonia sobre el disco embebido en el reactivo de Kovacs para Oxidasa(naftol+dimetilparafenilendiamina) extendiendo bien el material..C)-Esperar 5-10 seg y observar la coloraciónPrueba Positiva: la tira vira a color azul por oxidación del compuesto a azul de indofenolPrueba Negativa: no hay modificación2) Prueba de la CatalasaEsta prueba es para detectar presencia de la enzima catalasa enpreparaciones de microorganismos.Diferencia Streptococcus (-),Clostridium (-), de Staphylococcus (+), Bacillus (+) y Micrococcus(+).Metodología:A) Colocar una gota de agua en un portaobjeto limpio.B) Colocar una ansada de la colonia a probar sobre la gota y mezclar (no dejar secar).C) Agregar 2 gotas de Agua oxigenada.
Resultado positivo: formación de burbujas debido a laproducción de O 2 a partir del H 2 O 2 por acción dela enzima.3) Prueba del agar hierro-dos azucares de KliglerPermite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especificoincorporado a un medio de crecimiento básico asi como la produccion de gas y acido sulfhidrico.Se suele utilizar para la identificacion de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae.Metodología:1- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncion y por estría en el mismo tubo deagar hierro de Kligler.2- Incubar a 37ºC durante 18-24 h3- Observar entre las 18 h y las 24 h de cultivo (ni antes ni despues)Resultados:El uso de un hidrato de carbono implica la liberacion al medio de productos acidos capaces de serdetectados por un indicador de pH. Si el microorganismo en cuestion es incapaz de usar el H de C,consume entonces las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el mismo. Al interpretarlosd datos de la prueba debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos:A)Utilizacion del hidrato de carbono:*Si el microorganismo en estudio solo fermenta glucosai) en superficie:reaccion alcalina, color rojoii) en profundidad: reaccion acida, color amarillo*Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa:i) en superficie: reaccion acida, color amarilloii) en profuindidad: reaccion acida, color amarillo*Si el microorganismo no es capaz de fermentar glucosa ni lactosa (no enterico)i) en superficie: reaccion alcalina, color rojoii) en profundidad: si es aerobio entonces no hay crecimiento ni cambio de color; si esfacultativo entonces hay reaccion alcalina y color rojo* Si el microorganismo no es capaz de fermentar lactosa pero si de oxidarlai) en superficie: reaccion acida en tiempos cortos (color amarillo) luego reaccionalcalina y color rojo.ii) en profundidad: no hay crecimiento ni cambio de color.B) Produccion de gas• Si el microorganismo en estudio es aerogenico, la produccion de H 2 y CO 2se manifiestan por la formacion de burbujas y/o el desprendimiento de delagar del fondo del tubo, dejando un area clara• Si el microorganismo en anaerogenico, entonces no hay liberacion de gases2• Si el microorganismo produce este acido, el mismo reaccionara con el hierroformando un precipitado de SFe insoluble (color negro)• Si no produce el acido no habra reaccion
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