MICROBIOLOGIA GENERAL Guia de Trabajos Prácticos

CAMBIOS GENÉTICOSEl genoma de una bacteria puede sufrir cambios debidos a mutaciones o a la incorporación de un ADNexógeno, muchas veces trayendo como consecuencia un cambio en el fenotipo de la bacteria. Mutación:Se le llama así al cambio heredable en la secuencia de bases del ácido nucleico del organismo.La incorporación del ADN exógeno dentro de una bacteria puede a su vez ser por transducción(transporte de ADN por bacteriófagos), transformación (incorporación de fragmentos de ADN a bacteriascompetentes) o por conjugación (transferencia de ADN entre dos bacterias por contacto físico entre ellas).Objetivo:Producción de cambios en el genotipo de una bacteria por:a) conjugación y complementación funcionalb) transposición y generación de mutantes por inserciónDesarrollo:Comisión Aa) Complementación funcional de una mutante por conjugación biparentalBacteria receptora: cultivo de la mutante pgm de Agrobacterium tumefaciens, carente de la enzimafosfoglucomutasa. Esta mutante es incapaz de transformar Glu-6-P en Glu-1-P, por lo tanto es incapaz degenerar ADP-Glu y UDP-Glu, los dadores de glucosas activadas para la síntesis de todos los polisacáridosestructurales y de reserva que contengan glucosa. Esta mutante es pleiotrópica y por carecer delexopolisacárido tiene un fenotipo DARK al iluminar con UV placas conteniendo calcofluor. Esta mutantees resistente al antibiótico Kanamicina.Bacteria donadora: un cultivo de Escherichia coli S17.1, que contiene el plásmido pCC15, el cual lleva lasecuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens. Esta cepa es resistente al antibiótico Carbenicilina,dicha resistencia es portada en el plásmido pCC15. PROCEDIMIENTO. Se toman 1 ml de cada cultivolíquido (dadora y receptora) y se centrifugan en un mismo tubo Eppendorff. Una vez centrifugados selava con 1 ml de medio LB.Se centrifuga nuevamente, se resuspende en 30 µl de LB y se deposita sobre una placa de LB sólido, sinantibióticos. Se incuba a 28 o C por una noche.Al día siguiente se plaquea por rastrillado la mezcla de conjugaciónen el medio selectivo: Medio LB-Kanamicina (50 µg/ml)-Carbenicilina (100 µg/ml)-Calcoflúor 0,02%.Se plaquean también en el mismomedio, la cepa receptora ydonadora por separado como control.Incubar 48 hs a 28 °C.Observar la reversión del fenotipo DARK a BRIGHT al iluminar la placa con luz UV.