Capítulo 33. Toxicología - Instituto Nacional de Seguridad e Higiene ...

HERRAMIENTAS Y ENFOQUESde esos factores por sí sólo hubiera tenido un efecto tanprofundo sobre las estrategias de los ensayos de toxicidad.Concepto de los ensayos de toxicidad in vitroEn esta sección nos ocuparemos únicamente de los métodos deevaluación de la toxicidad que se realizan in vitro, como una de lasvarias alternativas a los ensayos con animales completos. En otrassecciones de este capítulo se examinan otras opciones distintas deluso de animales, como la elaboración de modelos informáticos ylas relaciones estructura-actividad cuantitativas.Los estudios in vitro se realizan generalmente en células otejidos animales o humanos fuera del cuerpo. La expresión “invitro” (“en vidrio”) se refiere a los procedimientos que se realizansobre material vivo o componentes de material vivo en placaspetri o en tubos de ensayo en unas condiciones definidas. Locontrario son los estudios “in vivo”, es decir, realizados “en elanimal vivo”. Aunque es difícil, si no imposible, proyectar losefectos de una sustancia química sobre un organismo complejocuando las observaciones se limitan a un único tipo de células enuna placa, los estudios in vitro sí que proporcionan una notablecantidad de información sobre la toxicidad intrínseca, así comosobre los mecanismos celulares y moleculares de la toxicidad.Además, ofrecen muchas ventajas sobre los estudios in vivo, sobretodo que son en general más baratos y que pueden controlarsemejor las condiciones en que se realizan. A ello hay que añadirque, pese a que sigue siendo necesario contar con algunosanimales para obtener las células que se van a cultivar in vitro,estos métodos pueden considerarse como alternativas válidas enel sentido de la “reducción” (pues se emplean muchos menosanimales que en los estudios in vivo) y del “refinamiento” (porqueeliminan la necesidad de someter a los animales a las consecuenciastóxicas adversas inevitables en los experimentos in vivo).Para interpretar los resultados de los ensayos de toxicidad invitro, determinar su utilidad potencial en la evaluación de la toxicidady relacionarlos con el proceso toxicológico general in vivo,es necesario comprender qué parte del proceso toxicológico seestá examinando. El proceso toxicológico completo consiste enunos fenómenos que se inician con la exposición del organismoa un agente físico o químico, prosiguen con las interaccionescelulares y moleculares y acaban manifestándose en la respuestadel organismo completo. Los ensayos in vitro suelen limitarse a laparte del proceso toxicológico que se desarrolla al nivel celular ymolecular. Los estudios realizados con este método puedenproporcionar información sobre por ejemplo las rutas metabólicas,la interacción de metabolitos activos con dianas celulares ymoleculares y parámetros o “puntos finales” de la toxicidad quepueden medirse y que por lo tanto pueden utilizarse comobiomarcadores moleculares de la exposición. Lo ideal seríaconocer el mecanismo de toxicidad de todas las sustanciasquímicas, desde la exposición hasta la manifestación en el organismo,de tal manera que la información obtenida en los ensayosin vitro pudiera interpretarse y relacionarse íntegramente con larespuesta del organismo en su conjunto. Pero ello es prácticamenteimposible, pues hasta el momento son relativamentepocos los mecanismos toxicológicos que se ha logrado elucidaren su totalidad. Por ello, los toxicólogos se enfrentan a una situaciónen la que los resultados de un ensayo in vitro no pueden utilizarsecomo una predicción totalmente exacta de la toxicidad invivo porque se desconoce el mecanismo. No obstante, esfrecuente que durante el proceso de desarrollo de un ensayo invitro se logren comprender algunos componentes del mecanismoo mecanismos celulares y moleculares de la toxicidad.Una de las cuestiones clave que están sin resolver en cuanto aldesarrollo y realización de ensayos in vitro es la que se refiere a laconsideración siguiente: ¿deben tener una base mecanicista, obasta con que sean descriptivos? Desde una perspectivacientífica es incontestablemente mejor utilizar sólo ensayos debase mecanicista para sustituir a los ensayos in vivo. Pero, ante laausencia de conocimientos mecanicistas completos, la posibilidadde desarrollar ensayos in vitro que sustituyan totalmente alos ensayos con animales enteros en el futuro próximo es casinula. No obstante, ello no descarta la utilización de tipos deensayos más descriptivos como instrumentos de detecciónprecoz, como es el caso en la actualidad. Con esos métodos dedetección se ha conseguido reducir notablemente el usode animales. Por consiguiente, hasta que llegue el momentoen que se genere más información mecanicista, puede ser necesarioemplear de manera más limitada ensayos cuyos resultadossimplemente tengan una buena correlación con los obtenidosin vivo.Ensayos de citotoxicidad in vitroEn esta sección se describirán varios ensayos in vitro que se handesarrollado para evaluar el potencial citotóxico de una sustanciaquímica. Son en su mayoría ensayos fáciles de realizar, y elanálisis puede automatizarse. Un ensayo de citotoxicidad in vitroque se utiliza habitualmente es el ensayo rojo neutro. Se realizaen células en cultivo, y en la mayoría de las aplicaciones lascélulas pueden mantenerse en placas de cultivo que contienen 96pocillos, cada uno de 6,4 mm de diámetro. Como cada pocillopuede utilizarse para una sola determinación, este sistemapermite emplear múltiples concentraciones de la sustancia asícomo controles positivos y negativos con un número suficiente dereplicaciones para cada caso. Tras el tratamiento de las célulascon diversas concentraciones de la sustancia que se ensaya, queabarcan al menos dos órdenes de magnitud (por ejemplo,de 0,01 mM a 1 mM), así como con sustancias de control positivoy negativo, las células se lavan y tiñen con rojo neutro, un coloranteque puede absorber y retener únicamente las células vivas.La tinción puede realizarse nada más retirar la sustancia ensayada,y entonces se observan los efectos inmediatos, o puederealizarse también en diversos momentos posteriores paraobservar los efectos acumulados o retardados. La intensidad delcolor en cada pocillo corresponde al número de células vivas enese pocillo. La intensidad del color se mide mediante un espectrofotómetro,que puede estar equipado con un lector de placas. Ellector se programa para que proporcione mediciones individualesde cada uno de los 96 pocillos de la placa de cultivo. Esta metodologíaautomatizada permite al investigador realizar rápidamenteun experimento de concentración-respuesta y obtenerdatos útiles desde el punto de vista estadístico.Otro ensayo de citotoxicidad relativamente sencillo es el quese realiza con la prueba MTT. El MTT (bromuro de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio)es un colorante de tetrazolioque se reduce a color azul por la acción de enzimasmitocondriales. Sólo las células con mitocondrias viablesconservan la capacidad de efectuar esa reacción; por lo tanto, laintensidad del color está directamente relacionada con el gradode integridad de las mitocondrias. Es un ensayo útil paradetectar compuestos citotóxicos generales, así como los agentesque tienen a las mitocondrias como diana específica.También se utiliza como ensayo de citotoxicidad de amplioespectro la medida de la actividad de la lactico deshidrogenasa(LDH). Esta enzima está presente normalmente en el citoplasmade las células vivas y se libera en el medio de cultivo celular alpermeabilizarse la membrana de las células muertas o moribundasque se han visto afectadas por un agente tóxico. Tras laaplicación de la sustancia ensayada a las células se retiran endiversos momentos pequeñas cantidades del medio de cultivo delas células para medir la cantidad de LDH liberada y determinarel curso temporal de la toxicidad. Aunque no permitemás que una evaluación muy general de la citotoxicidad, el valor33.52 ENSAYOS DE TOXICIDAD IN VITRO ENCICLOPEDIA DE SALUD Y SEGURIDAD EN EL TRABAJO