9 Biotec MV Neurospora 12-13

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Neurospora crassa
e
associazione cromosomica
Lezione 9 (Cap.13 iRussell)

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Terreni di coltura
Generalmente i terreni di coltura sono delle soluzioni solide o liquide contenenti
sostanze nutritive su cui è possibile crescere cellule eucariote e procariote. I terreni di
coltura batterici, cioè quelli su cui è possibile crescere colonie batteriche e altri
procarioti, sono più semplici di quelli eucariotici.
Un terreno può essere reso solido semplicemente aggiungendo agar agar all’1,5%.
L’agar è un polisaccaride strutturale, estratto da un’alga rossa, che funge da agente
solidificante trasformando il terreno in gelatina, e che non viene digerito dai batteri. È
molto utile quando occorre coltivare microrganismi in superficie. Se sappiamo quale
organismo dobbiamo isolare e conosciamo il suo metabolismo, possiamo allestire il
terreno di coltura con tutti i nutrienti di cui il microrganismo ha bisogno. (Non si
deve trascurare né il pH né la temperatura)
Gli elementi fondamentali per la crescita dei microrganismi sono: C, H, O, N, S, P
(contenuti in amminoacidi, zuccheri ed acidi nucleici). Un terreno minimo e’ un con
un minimo di nutrienti e privo di amminoacidi e come fonte di carbonio il glucosio.

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Studiando procarioti ed eucarioti

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
1. Come si identificano e contano i mutanti?
Sistemi di selezione
2. Quali sono i caratteri che si seguono?
- biosintesi di aminoacidi
- utilizzo di zuccheri
- resistenza ad antibiotici
I batteri e lieviti si definiscono auxotrofi se sono incapaci di sintetizzare
molecole essenziali, ceppi che viceversa sono capaci di sintetizzare tutte
le molecole essenziali sono definiti prototrofi

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Replica plating

coltura
(10 9 batteri)
Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Selezione per mutanti della biosintesi di aa
si cercano i mutanti aa - (esempio trp - )
Partiamo da
wild-type (trp + )
terreno con trp
crescono trp +/-
replica plating
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni mutanti per il trp
terreno minimo
crescono trp +
batteri trp -

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Selezione per mutanti dell’utilizzo di zuccheri
si cercano i mutanti zucchero - (esempio lac - , lattosio - )
coltura
(10 9 batteri)
Partiamo da
wild-type
terreno minimo
crescono lac +/-
replica plating
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni mutanti per il lattosio
terreno con lattosio
crescono lac +
batteri lac +

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Selezione per mutanti
della resistenza ad antibiotici
si cercano i mutanti antibiotico r (esempio strp r , streptomicina resistente)
coltura
(10 9 batteri)
Partiamo da
wild-type
terreno minimo
crescono strp r/s
replica plating
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni resistenti alla streptomicina
terreno con strept.
crescono strp r
batteri strp r

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Ciclo vitale del S.cerevisiae
aschi non
ordinati

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Ciclo vitale
della
Neurospora
crassa

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
meiosi e formazione delle ascospore
Zigote diploide
Anafase prima divisione meiotica
Anafase seconda divisione meiotica
Anafase divisione mitotica
Inizio formazione di otto spore aploidi
per asco
Asco con otto spore aploidi mature
Prodotti prima divisione meiotica
Prodotti seconda divisione meiotica
Prodotti divisione mitotica

B B
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meiosi
assenza di
ricombinazione
nessun crossing over
ricombinazione
crossing over
meiosiI
meiosiI c/o
b
b
B
B
b
b
B
B
meiosiII
meiosiII
b
b
B
B
b
B
b
B
b
mitosi
b
B
mitosi
B
b
mitosi
B
b
mitosi
B
b
b
b
b
B
B
B
B
b
b
B
B
b
b
B
B
segregazione
in prima
divisione meiotica
segregazione
in seconda
divisione meiotica

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
aschi non ricombinanti vs. ricombinanti
Segregazione in I
divisione meiotica
Segregazione in II divisione meiotica

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Diplotene/
metafase Anafase I Anafase II
A
a
A
A
a
a
A
A
a
a
a
a
a
a
a
A
A
A
A
A
A
a
A
a
A
a
a
A
A
a
A
a
a
A
a
A
A
a
a
A
a
A
tetrade
ordinata
Segr Fattori
coinvolti
pre-riduzionale
post-riduzionale
orientamento dei
bivalenti in metafse I
orientamento degli univalenti
in metafse II
Posizione dei
crossing-over e
segregazione
degli alleli

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Parentali aploidi (N)
Tipi di tetradi con i
genotipi della progenie
aploide (n)
Dr. Mario Ventura
Tipi di tetradi prodotti
b+
a+
selvatico
Parentale1
Zigote diploide (2N)
DITIPO
PARENTALE (DP)
a+ b+
a+ b+
a
a
b
b
parentale
parentale
parentale
parentale
MEIOSI
a+
b+ b
Fusione
cellulare
a
TETRATIPI
(T)
a+ b+
a+ b
a
a
b+
b
parentale
ricombinante
ricombinante
parentale
b
Parentale2
a
doppio mutante
DITIPO NON PARENTALE
(DNP)
a+ b
a+ b
a
a
b+
b+
ricombinante
ricombinante
ricombinante
ricombinante

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Origine dei diversi tipi di tetradi..considerando due geni
a
a
a+
b
b
b+
a+ b+
a
a
a+
a+
a
a
a+
a+
a
a
a+
a+
b
b
b+
b+
b
b
b+
b+
b
b
b+
b+
Nessun Crossing
over
Singolo Crossing
over
Doppio
Crossing over
(A 3 filamenti)
Doppio
Crossing over
(A 4 filamenti)
a b
a b
a+ b+
a+ b+
a b
a
b+
a+ b
a+ b+
a b
a b+
a+ b+
a+ b
a b+
a b+
a+ b
a+ b
Tipi di asco
a b
a b
a+ b+
a+ b+
a b
a b+
a+ b
a+ b+
a b
a b+
a+ b+
a+ b+
a b+
a b+
a+ b
a+ b
Ditipo parentale (PD)
(4 parentali)
Tetratipo (T)
(2 parentali, 2 ricombinanti)
1/2 sono ricombinanti
Tetratipo (T)
(2 parentali, 2 ricombinanti)
1/2 sono ricombinanti
Ditipo non parentale (NPD)
(4 ricombinanti)
TUTTI SONO RICOMBINANTI

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
1. Distanza gene1-gene2:
MAPPATURA GENETICA
Ricombinanti
Gene1-Gene2 = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali

Università d`i Bari
Origine dei diversi tipi di tetradi...considerando gene-centromero
…essendo tetradi ordinate si puo’ calcolare la distanza tra un gene ed il centromero
- il centromero e’ un marcatore
- si puo’ in Neurospora crassa e non in Saccaromices cerevisiae
Cellula diploide
A
A
a
a
1 a divisione meiotica
NESSUN CROSSING-OVER
Asco in sviluppo
A
a
A
Per determinare la distanza gene-cen, bisogna trovare la frequenza di
ricombinazione….BISOGNA PREDIRE LE CONSEGUENZE DI UN SINGOLO EVENTO DI
CROSSING-OVER TRA IL LOCUS IN ESAME ED IL CENTROMERO
Dr. Mario Ventura
a
2 a divisione
meiotica
A
A
a
a
MITOSI
A
A
A
A
a
a
a
a

Università d`i Bari
Cellula diploide
A
A
a
Dr. SCAMBIO Mario Ventura CROMATIDI 2-4
a
1
2
3
4
1 a divisione meiotica
SCAMBIO CROMATIDI 2-3
Cellula diploide
A
A
a
a
1
2
3
4
1 a divisione meiotica
CROSSING-OVER tra gene e centromero (4 possibilita’)
Asco in sviluppo
A
A
A
a
a
a
Asco in sviluppo
a
A
2 a divisione
meiotica
2 a divisione
meiotica
A
A
a
a
A
a
a
A
A
A
a
a
A
A
a
a
MITOSI MII
MITOSI
A
A
a
a
a
a
A
A
MII

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Da scambi tra i
cromatidi 1-4
a
a
A
A
a
a
A
A
MII
Da scambi tra i a
cromatidi 1-3 A
- In tutti i casi di scambio analizzati la segregazione dei geni (tra di
loro) e’ in seconda divisione meiotica
LA FORMULA RISOLUTIVA VIENE DALLA “SOLITA”
RELAZIONE TRA %RICOMBINANTI E DISTANZA
GENETICA
a
A
A
A
a
a
MII

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
1. Distanza gene1-gene2:
MAPPATURA GENETICA
Gene1-Gene2 = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali
2. Distanza gene-centromero:
Gene1-CEN = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali
Non potendo distinguere tra DNP e P, i DNP non si contano
tra i ricombinanti e si valutano solo i ricombinanti certi

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
Origine dei diversi tipi di tetradi..considerando due geni
a
a
a+
b
b
b+
a+ b+
a
a
a+
a+
a
a
a+
a+
a
a
a+
a+
b
b
b+
b+
b
b
b+
b+
b
b
b+
b+
Nessun Crossing
over
Singolo Crossing
over
Doppio
Crossing over
(A 3 filamenti)
Doppio
Crossing over
(A 4 filamenti)
a b
a b
a+ b+
a+ b+
a b
a
b+
a+ b
a+ b+
a b
a b+
a+ b+
a+ b
a b+
a b+
a+ b
a+ b
Tipi di asco
a b
a b
a+ b+
a+ b+
a b
a b+
a+ b
a+ b+
a b
a b+
a+ b+
a+ b
a b+
a b+
a+ b
a+ b
Ditipo parentale (PD)
(4 parentali)
Tetratipo (T)
(2 parentali, 2 ricombinanti)
1/2 sono ricombinanti
Tetratipo (T)
(2 parentali, 2 ricombinanti)
1/2 sono ricombinanti
Ditipo non parentale (NPD)
(4 ricombinanti)
TUTTI SONO RICOMBINANTI

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
1. Distanza gene1-gene2:
MAPPATURA GENETICA
Gene1-Gene2 = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali
2. Distanza gene-centromero:
Gene1-CEN = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali
Non potendo distinguere tra DNP e P, i DNP non si contano
tra i ricombinanti e si valutano solo i ricombinanti certi
Gene-cen=%Aschi segreganti in MII(=%T)/2

Dr. Mario Ventura
Università d`i Bari
1. Distanza gene1-gene2:
MAPPATURA GENETICA
Gene1-Gene2 = (1/2 T + NPD)/Tetradi totali
2. Distanza gene-centromero:
Gene-cen=%Aschi segreganti in MII/2
N.B. IN LIEVITO DOVE GLI ASCHI NON SONO ORDINATI SI PUO’ CALCOLARE SOLO LA
DISTANZA TRA I DUE GENI E NON GENE-CENTROMERO
ESERCIZI DAL TESTO……

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