molecole trasportatrici di o negli animali : mioglobina ed emoglobina

MOLECOLE TRASPORTATRICI DI O 2NEGLI ANIMALI : MIOGLOBINA ED EMOGLOBINARappresentazione schematica del trasportodi ossigeno negli animali.L’ossigeno è trasportato dall’emoglobina l daipolmoni o dalle branchie ai tessuti periferici.Quì una parte di esso può esseredirettamente utilizzata per il metabolismo.Un’altra parte può essere immagazzinatamediante il legame alla mioglobina e resaquindi disponibile quando la domanda diossigeno da parte dei mitocondri (dove il90% dell’ossigeno cellulare viene utilizzato)dei tessuti periferici è forte.La CO 2 , rilasciata dai processi ossidativirespiratori che hanno luogo nei mitocondridei tessuti periferici viene trasportata aipolmoni o alle branchie ed espirata.da: vH. Mathews

O 2 , essendo un gas, è poco solubile in soluzione acquosa. Lasua concentrazione in soluzione è proporzionale alla suapressione parziale.Sangue arterioso: pO 2 = 100 mm Hg (13,33 kPa);[O 2 ] = 0,13 mmol/lSangue arterioso: [Hb] = 150 g/l;[O 2 ] = 8,6 mmol/lLa presenza dell’Hb aumenta di ~ 70 volte la capacità delsangue di trasportare O 2 .O 2permette l’estrazione di energia da 1 molecola di glucosiomaggiore di15volte:Organismi anaerobi: 1 molecola di Glucosio →2 ATPOrganismi aerobi: 1 molecola di Glucosio → 30 ATPLa maggior disponibilità di energia utilizzabile dalla cellula percompiere lavoro (ATP) ha permesso l’evoluzione degli organismisuperiori sino all’uomo.

Eit Eritrocita = un sacchetto pieno di emoglobina e poche altremolecole; non contiene nucleo nè mitocondri; non si ha sintesiproteica. Necessità di vita breve non avendo la capacità disostituire eventuali componenti danneggiati.Eritrocita: t 1/2 20 gg Contenuto di Hb 150 g/lHb occupa gran parte del volume dell’eritrocita

MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA: proteine coniugatePROTEINE E CONIUGATE: apoproteina p + gruppo prosteticoApoproteina = catena polipeptidica = GlobinaGruppo prostetico → gruppo non proteico → Eme →responsabile del colore rosso per la presenza di Fe +2MIOGLOBINAEMOGLOBINA( monomerica)( polimerica)i Biochimica per le discipline biomediche ELSEVIER Srl 2011

Molecola purificata dai muscoli di capodoglioStruttura tridimensionale terziaria definita dal Premio Nobel Kendrew nel1950 con la cristallografia ai raggi X)153 AA; una sola catenapolipeptidica75% a-elica:8 segmenti(daA ad H);7 gomitiStruttura terziaria:core idrofobico: solo 4molecole di H 2 OTasca idrofobica tra isegmenti E ed F: legal’EMENella tasca idrofobica: solo2 His (AA idrofilici) = ruolofunzionale; devono essere acontatto con l’ambienteesternoHarper's. Biochimica illustrata. Ed.EMSI 2011

La Mioglobina ha un solo sito di legame per l’ossigenoda: Nelson & CoxCurva o gomito o ripiegamento4 proline nella molecolal’Eme è legato alla globinada numerosi legami deboliper lo più idrofobici e dallegame di coordinamentocon la His prossimale (F8)

EMOGLOBINA: prima proteina polimerica di cui è stata definita la strutturaquaternaria- Molecola quasi sferica ∅50Å; quattro cateneorganizzate a tetraedro,unite da interazioni noncovalentiHbA α 2 β 2- 4 Gruppi eme posti infessure vicine allasuperficie della molecola-I 4 siti per l’O sono Ogni subunità di Hb è molto2molto distanti fra loro, lasimile il alla catena delladistanza fra i due atomi dimioglobina: la catena α mancaFe più vicini è 25Ådel segmento D.Lega 4 molecole di O 2Harper's. Biochimica illustrata. Ed.EMSI 2011

EMOGLOBINA (Hb)Struttura tt tridimensionale i quaternaria studiata t ai raggi X (come la Mb)dal Premio Nobel Perutz 1936 → 1959- 4 catene polipeptidiche unite da interazioni non covalentiNell’adulto 98% Hb A → α 2 β 22% Hb A δ2% Hb A 2 → α 2 δ 2Nell’embrione Hb E → α 2 ε 2 ζ 2 ε 2 ζ 2 γ 2Nel feto Hb F → α 2 γ 2Catena αζ141 AACatene β δ γ 146 AA molto simili tra loroHarper's. Biochimica illustrata. Ed.EMSI 2011

Sono note le sequenze AA delle Hb da più di 60 specie (lampreda → uomo).Notevoli variabilità per la maggior parte delle posizioni in quasi tutte le specie.In 9 posizioni però c’è cèsempre lo stesso AA (residui costanti:costrizioni funzionali)RESIDUI ESSENZIALI DELLA EMOGLOBINA (costrizioni funzionali)PosizioniF8E7CD1F4B6C2HC2C4H10AminoacidiHisHisPheLeuGlyProTyrThrLysRuoloIstidina prossimale, lega EmeIstidina distale, vicina EmeIn contatto con Eme*In contatto con Eme*Permette la stretta vicinanza tra eliche B e ETermine dell’elica (gomito della catena polipept.)Lega tra loro eliche H e FLe forti caratteristiche non polari dell’interno si conservano inalterate a causa dellasostituzione tra AA idrofobici. Molto più variabili sono i residui della superficie dellamolecola.* Contribuisce a creare l’ambiente idrofobico necessario all’eme ostruendonela tasca idrofobica.

Confronto tra la struttura primaria (sequenze AA) della Mb di Capodoglio e lecatene α e β di Hb umana (confronto tra proteine diverse che hanno la stessafunzione)Solo 27 AA risultano identici dal confronto delle catene Mb, Hbα e Hbββo identicima ~ 40% o sostituzioni conservative (AA con le stesse caratteristiche,i.e. R idrofobico con R idrofobico)Le somiglianze sono maggiori tra le catene α e β di Hb che non tra queste e Mb a causadelle DIVERSE PRESSIONI EVOLUTIVE sul gene della catena mioglobinica →monomerica e su quelli delle catene dell’Hb → oligomeri di un tetrameroNelle catene α e β occorrono sulla superficie di contatto, potenzialità di legame einterazioni non richiesta nella Mioglobina:13 residui che nella struttura terziaria occupano posizioni analoghe:- sono polari perché rivolti verso la soluzione acquosa nella mioglobina- sono idrofobici perché si trovano nelle zone di contatto degli oligomeri nelle catene αe β

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Confronto tra la struttura terziaria di Mb e di una subunità Hbda: Nelson & Cox→ Sequenze molto diverse possono specificare strutture moltosimili

RAPPORTO GLOBINA:EMEIn H 2 O, l’eme leme isolato è in grado di legare l’O lO 2 solo per un attimo, poiché l’Eme lEme ferroso siossida molto rapidamente a EME ferrico con la formazione di un intermedio EME-O 2 -EME, sandwich, l’ossigeno viene legato irreversibilmente.Ruolo dell’apoproteinaL’avvolgimento globinico è l’avvolgimento nello spazio di una catena polipeptidica che portaalla formazione di una cavità idrofobica per l’EME: lEME: porta 60 e più atomi di residui apolaridella proteina a contatto con l’Eme.In generale: la funzione di un gruppo prostetico dipende in parte dall’ambiente proteicoche lo circonda. Es. eme trasporta elettroni invece di O 2 in citocromo c e catalasi.In Mb e Hb la His distale e altri residui intorno all’EME impediscono la formazionedell’intermedio EME-O 2 -EME.il sito non polare che lega l’eme, escludendo l’H 2 O dall’ambiente, PROTEGGE LO STATOFERROSO DELL’EME DALL’OSSIDAZIONE (è molto più difficile strappare un e - )SOLOnello stato ferroso l’eme lemelegalega l’ossigeno reversibilmente.La FUNZIONE DELLA GLOBINA non è tanto quella di fare da supportoall’Eme, quanto fornire al ferro un microambiente idrofobico essenziale perlo scambio di O 2

EME in Mb e Hb= PROTOPORFIRINA IX + Fe +2(parte organica) (parte inorganica)PROTOPORFIRINA:4 gruppi pirrolici uniti da pontimetinici, anello tetrapirrolicoplanarePROTOPORFIRINA IXSostituenti:4METILI2 VINILI2 PROPIONATIFe-protoporfirina IX

Il Fe +2 forma 4 legami di coordinazione con i 4 N della protoporfirina (sul pianodell’EME)Il Fe +2 può formare altri 2 legami (5 a e 6 a posizione di coordinazione) indirezioni opposte tra loro e perpendicolari al piano dell’EME.5NNNN6

da: Nelson & Cox(prossimale, F8)-Il Fe +2 si lega ad una delle istidine con la 5 a posizione di coordinazione del Fe +2 :His F8 o His PROSSIMALE-l’O 2 si lega all’eme con la 6 a posizione di coordinazione del Fe +2 . Il sito di legamedi O 2 si trova sul piano dell’EME dal lato opposto ad F8-Fe+2 (Ferroso) → Ferromioglobina-Fe+3 (Ferrico) → Ferrimioglobina (o metamioglobina)Solo la prima forma è capace di legare in forma reversibile O 2Un secondo residuo di istidina HIS E7-HIS DISTALE si trova nelle vicinanzee forma un legame H con l’O 2

da: Nelson & Cox

• Il gruppo EME è situato t nella tascaidrofobica della mioglobina• Le catene laterali di propionato puntanoverso la superficie i della molecola l : a pHfisiologico sono ionizzate• -Il resto dell’EME è dentro la tascacircondato da residui i non polari:fannoeccezione le 2 istidine F8 ed E7• -Il Fe +2 nella deossimioglobina è spostatodi circa 0.3 Å fuori dal piano dell’EMEverso l’His prossimaleLo stesso vale per la Emoglobina

Basi strutturali della diminuita affinità di Mb e Hb per COMb ed Hb legano anche CO: molto importante dal punto di vista biologico perchéil metabolismo dell’EME libera CO1% dei siti Hb e Mb occupati da CO tollerabilese Hb e Mb affinità EME = per CO libero intollerabileEME libero e in soluzione lega CO 25000 > di O 2Mb e Hb affinità per CO 200 > O 2E’ stato dimostrato attraverso:•RX su cristalli•Spettroscopia dell’IR dei complessi CO e O 2 con Mb•Modelli sinteticiche la diminuita affinità di Mb e Hb per CO sta nella diversa geometria degliangoli Fe-CO nell’EME libero e nella CO-Hb o CO MbCO = veleno = blocca trasporto di O 2 : diminuisce siti disponibili a legare O 2Fumo = occupazione di molti siti di Hb da CO: respirazione alterata

Mb e Hb legano COda: Campbell & Farrell(a) Eme liberocon imidazolo(b) ComplessoMb:CO(c) OssimioglobinaHarper's. Biochimica illustrata. Ed.EMSI 2011L’ossigeno e il monossido di carbonio legati al gruppo EME della mioglobina.La presenza dell’istidina E7 forza l’ossigeno o il CO a formare un legame con un angolodi 120°

CONFORMAZIONI strutturali della EMOGLOBINA funzionali altrasporto di OssigenoE’ stata postulata e poi dimostrata l’esistenza di due strutture quaternarie per l’Hb- una forma con legami più numerosi e più forti, con minore affinità per O 2 – Forma T(tesa)- una forma con legami più scarsi o più deboli, con maggiore affinità per O 2 – Forma R(rilassata) e la transizione TR in seguito a ossigenazione.

1) I cristalli di Hb si rompono quando l’Hb viene ossigenata ⇒ struttura #2) Diverso spettro O.D. emoglobina ossi e deossi3) Studio ai RX ⇒ # struttura 4 aOssigenazione ⇒i due EME β si avvicinano (39.9 33.4Å)i due EME α si allontananola cavità centrale si restringeHarper's. Biochimica illustrata. Ed.EMSI 2011

Variazioni della struttura quaternaria e nuovi contatti tra lesubunita’ in seguito a ossigenazioneEsistono stono 6 superfici di contatto tra le 4 catene (legami H)La forma a coda di rondine della superficie α 1 β 2 di contatto, mette in grado le duesubunità di scivolare facilmente l’una sull’altra: si rompono alcuni legami deboli, altrise ne formano.

Transizione strutturale TR in seguito ad ossigenazioneO 2da: Nelson & Co ox

Altri legami che rendono compatta la forma TDPG abbassa l’affinità per O 2 perché crea legami addizionali tra le subunitàstabilizzando la struttura quaternaria della deossiemoglobina (forma T).

- il DPG si lega 1:1 con deossi Hb- Il DPG si lega nella cavità centrale dideossi Hb- residui carichi+ di entrambe le catene βdi deossi Hb interagiscono con lecariche– del DPG (5 a pH fisiologico)La transizione TR si ha per:a) rottura dei legami ionici chestabilizzano lo stato T della deossi Hbb) espulsione di DPG dalla cavità di deossiHb che si restringe: diminuisce ladistanza tra le eliche H delle catene βed aumenta la distanza dei gruppiterminali NH 3+che non possono piùrimanere in contatto col DPG: quindiperdita dei legami che contribuivano arendere compatta la forma T.da: Voet & Voet (II Ed.)

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MODELLI PER SPIEGARE L’EFFETTO COOPERATIVOMODELLO CONCERTATO O SIMMETRICO O DI MONOD, 19651. In assenza di O 2 esistono le forme T ed R in equilibrio:2. L’equilibrio è spostato verso la forma T che è la meno affine a O 23. Il legame di una molecola di O 2 a una subunità di T trasforma tutto il tetramero in R:questo significa che è possibile solo un effetto cooperativo positivoDa: Strayer L.

MODELLO SEQUENZIALE O DI KOSHLAND1. In assenza di O 2 esiste solo la forma T2. Il legame di una molecola di O 2 a una subunità di T altera laconformazione solo di quella subunità3. La subunità che ha subito un cambio conformazionale stabilisce nuovicontatti con le altre subunità che possono favorire o sfavorire il legamedel ligando (sono possibili effetti cooperativi positivi e negativi)può farDa: Strayer L.

Spiegazione dell’effetto Cooperativo:La deossiemoglobina è una molecola l rigida id per gli otto legami salini i eperi legami conil DPG. La affinità dei suoi gruppi eme per l’ossigeno è molto bassaL’ossigenazione ha luogo soloquando alcuni di questi legami salini vengono spezzatidal legame di una prima molecola di ossigeno all’eme che permette al Fe +2 dispostarsi verso il piano dell’EME.Il movimento trascina con sè l’istidina prossimale nonché tutta l’elica F.Questo fa sì che la subunità α cui il primo ossigeno si è legato cambi conformazionein seguito alla rottura intracatena di alcuni legami e alla formazione di nuovi.Il cambiamento conformazionale di una subunità influenza i legami intercatena chetenevano la subunità legata alle altre portando,man mano che la pressionedell’ossigeno aumenta ,al progressivo indebolmento fino alla rottura dei legamisalini intercatena. Ciò facilita il legame delle successive molecole di ossigenoIl cambiamento della struttura quaternaria fa restringere la cavità centrale diDeoxHb che non può più alloggiare il DPG che viene espulso.Si rompono così anche questi legami ionici favorendo sempre più il prevalere dellastruttura R di Hb,più affine all’ossigeno.L’affinità di O 2 per la forma T ed R è, rispettivamente, di 1:300.