Bruno Stefanon - Scienze Zootecniche

Benessere animale e riflessi sulla qualitàdelle produzioniprof. B. Stefanon –Università di Udine,Dr. A. Pirisi – Istituto Zootecnico Caseario della SardegnaDr.ssa A. Nudda - Università di SassariCONVEGNO DI STUDI SUIL BENESSERE ANIMALEE LA QUALITA’ DELLE PRODUZIONI NEI PICCOLIRUMINANTISassari 16 Dicembre 2005

Non c’è bisogno che tutto l’universo s’armi per schiacciarlo:un vapore, una goccia d’acqua basta per ucciderloBlaise Pascal, Pensieri, fr. 347OvveroNon cade una goccia nell’oceano senza che tutto l’universosi commuova

In termini biologiciOmeostasi e Omeoresi

L’animale attua una serie di adattamenti metaboliciindirizzati al mantenimento di uno stato fisiologico(OMEORESI), rispettando nel contempo, attraversoun efficiente sistema a feed-back, la costanza di unadata funzione (OMEOSTASI).Entrambi questi meccanismi, omeoretico eomeostatico, sono necessari affinché l’animalemantenga inalterato l’equilibrio fisiologico.

Stress (Devoto-Oli)Tensione, PressioneovveroSottoporre a Sforzo, a SollecitazioneStress (Moberg)Risposta biologica ad eventi che un individuo “percepisce”come minaccia alla propria omeostasiStressA differenza di molte malattie non ha una eziologia, unapatogenesi e una prognosi definita

Fattori di stress negli allevamenti• dimensioni e pavimentazione cuccette• pulizia• tipi di cattura e contenimento• numerosità e modificazione dei gruppi• interazione con gli addetti• percorsi e movimentazione per la mungitura• impianto di mungitura e sua gestione

Identificazione di unpericolo per l’omeostasi:Risposta animale allo stress (Moberg, 1999)Stimolo• Regime Alimentare• Ambiente, Stalla• Età• Fase fisiologica• Stagione• TrasportoRisposta allo stressSistema Nervoso CentralePercezione dello stressOrganizzazione delle difese biologicheRisposta BiologicaComportamentale – Neuroendocrina - ImmunologicaFunzioni Biologiche Normali+Funzioni Biologiche AlterateConseguenze dello stressStato prepatologicoSviluppo della patologia

Fattori stressantiipofisicortecciasurrenesistema nervosoCortisolo Riserve corporee CatecolamineImmunodepressioneAttività metabolica+ glucosio + NEFA +aminoacidiAnimale vigile: >frequenza cardiacae respiratoria

Conseguenze metaboliche dello stressTessuti bersaglio dello stress e utilizzo dei nutrienti

Uno dei più importanti effetti legati all’aumento dellasecrezione di glucocorticoidi durante lo stress riguarda larisposta con metaboliti essenziali che divertono glucosiodai muscoli verso il cervello ed altri tessuti

Stressors associati ad aumento di secrezione dicortisolo indotti dall’asse HPA nel bovino• Trasporto (Locatelli et al. 1989)• Temperatura ambientale (Lacetera et al., 2005)• Restrizione alimentare (Fürll et al. 1993)• Restrizione di acqua• Manipolazione terapeutica (Nakao et al. 1994)• Interventi chirurgici (Fisher et al. 2001; Sylvester et al. 1998)

Cortisolo ematicoStress da intervento chirurgico su vacche Frisone (Mudron et al. 2005)cortisolo (ug/L)4540353025201510500 1 2 5 24 72distanza dall'evento stressante (ore)

Glucosio ematicoStress da intervento chirurgico su vacche Frisone (Mudron et al. 2005)765432100 1 2 5 24 72

FFA nel sangueStress da intervento chirurgico su vacche Frisone (Mudron et al. 2005)3,53FFA (mmol/L)2,521,510,500 1 2 5 24 72distanza dall'evento stressante (ore)

Priorità di utilizzo dei nutrienti in relazione alle esigenzemetaboliche (Elasser et al., 2002)GrassoMuscoloOssaCervello eSNCNutrienti nel sangueFeto / Placenta

Lo stress ha un costo biologico• Gli eventi stressori inibiscono la deposizione dienergia sulla massa magra e grassa e comportantoriduzione dell’accrescimento (Laugero & Moberg, 2005)• Eventi stressori multipli hanno un effetto inibitoriosuperiore a quello causato dal singolo evento

Poiché la risposta allo stress ha un costobiologico per l’organismo ….…..La risposta ad un evento stressante può esserelegata, oltre che all’intensità dello stimolo, anchealle condizioni energetiche dell’animale

Stress da restrizione alimentareProva su pecore di razza SardaNudda, Pirisi, Pulina, 2005

Soggetti utilizzati• 20 pecore–10 con BCS ≤ 2,5 (Basso-BCS)–10 con BCS ≥ 3,5 (Alto-BCS)• Gabbie individuali per tutta la duratadell’esperimento• Periodo presperimentale: tutti gli animali alimentaticon unipellet in quantità pari alle esigenzeenergetiche degli animali (2 kg)

TrattamentiGruppo trattato - Stress alimentare – 50% esigenze energeticheBasso-BCSAlto-BCSGruppo di controllo – alimentazione ad libitumBasso-BCSAlto-BCS

Fasi della prova• Preliminaretutti gli animali: 2 kg/d Unipellet• Sperimentale - stress (3 giorni)- gruppo stress: restrizione alimentare (50% delle esigenzeenergetiche degli animali) per 3 giorni consecutivi- gruppo controllo: disponibilità alimento ad libitum• Sperimentale - recupero (4 giorni):tutti gli animali: 2 kg/d Unipellet

LATTE160014001200- 26%***- 16%***latte (g/d)1000800600400200controllostress0stressperiodorecupero

GRASSO6,26+8.3%;*+14.3%;*grasso (%)5,85,65,45,2controllostress54,8stressperiodorecupero8070- 21.3%;**60grasso (g/d)504030controllostress20100stressrecuperoperiodo

PROTEINA65,5NSNSProteina (%54,5controllostress4stressperiodorecupero9080-24%;**-16%;**70Proteina (g/d)60504030controllostress20100stressrecuperoperiodo

CELLULE SOMATICHE800NS700CCS (x1000/ml600500400300200controllostress1000stressperiodorecuperototale CS (x1.000.000700600500400300200100NScontrollostress0stressrecuperoperiodo

Influenza della restrizione alimentare (stress) sulla produzione dilatte di pecore con Alto-BCS e Basso_BCS16001400-29%; P

Influenza della restrizione alimentare (stress) sulla produzione digrasso nel latte di pecore con Alto-BCS e Basso_BCS80-25% P = 0.014 NSgrasso (g/d)70605040302010controllostress0BCS_altoBCS_bassoLa riduzione della produzione di grasso per effetto dello stress alimentare è statasignificativa solo negli animali Alto-BCS. Nessun effetto negli animali Basso-BCS

Effetti dello stress da restrizione energetica– Riduzione della produzione di latte– Riduzione della produzione di grasso, di proteina e dilattosio– Aumento marcato di SCC (anche se non statisticamentesignificativo)– Nessuna influenza del BCS nella risposta allo stress perla produzione di latte, proteine e lattosio– Riduzione della produzione di grasso nel latte (g/d) solonel gruppo Alto-BCS sottoposto a stress

Interazione fra risposta neuro-endocrinaallo stress e il bilancio ossidoriduttivo(stress ossidativo)

StressAumento MetabolismoRadicali liberiAmplificazione DistressDanni cellulari

Radicale liberoAtomo che possiede uno o più elettroni spaiati,altamente reattivo per l’ottetto incompletoIntermedi di reazione ad elevato contenuto energetico,estremamente reattivi e quindi di vita breve e nonisolabiliAccettano (sottraggono) un elettrone nelle collisionicon altre molecole per aumentare la propria stabilità,ma le trasformano a loro volta in radicali, dando vita areazioni a catena

Siti di formazione dei radicali liberi nelle cellulesistema di trasporto deglielettronicitocromo P-450 e b-5mieloperossidasisistemi enzimatici(fagociti)xantina ossidasiemoglobinanucleolisosomaflavineridottereticoloendoplasmaticomitocondrioperossisomimembrana cellularemetalli ditransizioneossidasiflavoproteinelipossigenasiprostaglandine sintetasiNADPH ossidasi (fagociti)perossidazione lipidicasistema ditrasporto deglielettroni

Bersagli dei radicaliDirettiInteressano diverse strutture intra edextracellulari, alterandone la funzionalità:• Acidi grassi polinsaturi• Proteine• Acidi nucleiciInterferenza con importanti attivitàmetaboliche attraverso la competizione perl’utilizzo degli equivalenti riducenti:IndirettiDirottamento del glucosio verso la via deipentoso fosfatiMediati dall’attività dei prodotti dellaperossidazione lipidica

Variazioni principi nutritivi nella dieta estress ossidativo: PECORA(Colitti e Stefanon, 2005; Sgorlon et al., 2006)

AmidoGrassoAumento del GlucosioAumento acidi grassiGlicolisi AnaerobicaOssidazione diretta del glucosio NADPHOssidazione nei MitocondriAumento O 2Riduzione O 2Aumento ROSDiminuzione ROS

Animali• 24 pecore Bergamasche• Fecondate a fine estate in 10 giorni, con 2 arieti• Alimentate con fieno e concentrato per i seguenti 140 giorni• Somministrazione di una dieta completa pellettata fino al parto

Al parto• Pecore con un solo agnello assegnate a 3 gruppi sperimentali, ospitate in 3differenti box• Alimentate per i seguenti 33 giorni con la stessa razione (unipellet)CTRHST AMIDO 22.0 %; GRASSO 3.0%HFA

Da 33 a 50 giorni dal partoCTR: Amido 22.0 %; Grasso 3.0%HST: Amido 28.0 %; Grasso 2.5%HFA: Amido 16.0 %; Grasso 5.4%

Disegno sperimentale e schema di campionamento18 19 20 33 34 35 48 49 5015 20 25 30 35 40 45 50 55Days from lambingGiorni dal partoHST HFA CTR

GrassoFat content7.0%6.05.0Composizione del latte4.0**3.020d 35d 50dCTR STARCH AMIDO GRASSO FATProtein and lactose content7.06.0ProteinaLattosio%5.0* = P < 0.054.03.020d 35d 50d 20d 35d 50dCTR STARCH AMIDO FAT GRASSO

TCO24035**Emogas analisi30mmol/l2520151020d 35d 50dCTR STARCH FATpH7.67.6* **7.5Unità7.57.47.47.320d 35d 50dCTR STARCH FAT

SOD in BloodSuperossido dismutasi (SOD)50.0UI/l40.030.0*Markers di stressossidativo nel sangue20.020d 35d 50dCTR STARCH AMIDO FAT GRASSO6.0GSx in BloodGlutatione perossidasi (GPx)5.0* = P < 0.05um/ml4.03.02.01 2 3*CTR STARCH AMIDO FAT GRASSO

LisozimaLysozime in milkU.I./l7.06.05.04.03.0**Variabili “immunitarie”nel latte2.01.00.020d 35d 50dCTR STARCH FAT6.0SCCSCC*5.0ln* = P < 0.054.03.020d 35d 50dCTR STARCH FAT

Mammary apoptosis(Wilde, 2003)Cell nuclei in alveoli• Apoptosis evident as DNAladdering is induced bycomplete cessation of milking(cows)• Apoptotic cells in involutingbovine tissue visualised andcounted by TUNELApoptotic cells in alveoli

Mammary apoptosis during lactation(da Wilde, 2003)• TUNEL detects apoptoticcells in lactating tissue(cows)Apoptosis -bovine lactation

Espressione di mRNA Glutatione-S-Transferasi(GST) nella ghiandola mammariaGST2.001.601.200.800.40CTR HST HFAP < 0.05

Proliferation index%1.51.20.90.60.30.0CTR HST HFAApoptotic index2.41.8%1.2P < 0.050.60.0CTR HST HFA

Proliferation to Apoptosis1.20.9Ratio0.60.30.0CTR HST HFA

Variazioni principi nutritivi nella dieta estress ossidativo: BOVINA DA LATTEProgetto MIUR (PRIN), 1999-2001Responsabile Bruno Stefanon

Ipotesi di StudioModificazione composizione dietaEffetto stressante Neuroendoricno e MetabolicoAumento livello stress ossidativoModificazione attività cellulareModifica risposta ghiandola mammaria

Udine:Alimentazione eprofilometabolicoParma:analisi latteMilano:rispostaimmunitariaProf MarianiBovine inlattazioneProf ZecconiPerugia:stressossidativoProf GaitiPadova:endocrinologiaProf Gabai

Piano sperimentaleBovine in piena lattazioneVariazione repentine del contenuto di amidoValutazione nel breve periodo

Disegno sperimentaleAltoBassoStarch, %/DM361 2 3 45 6 732282420162 166 170 174 178 182DIMExp Ctr Sampling

Risposta produttiva21.020.5AltoLatte*Bassokg/d20.019.519.0166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dal partoCTREXP* = P < 0.05

Risposta endocrinaCortisolo16*12Altong/ml84Basso0166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dal parto* = P < 0.05CTREXP

AltoBassob-OHB8* *mg/100ml642166 168 170 172 174 176 178 180 182Risposta Metabolicagiorni dal partoCTREXP10080NEFA*umol/l604020166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dal parto* = P < 0.05CTREXP

AltoBassoGSH4.0*3.5uM3.02.52.0166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dal partoStress ossidativoCTREXP400350GPx* *UI/g Hb300250200150166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dasl parto* = P < 0.05CTREXP

Ghiandola mammariaSCC5.0* *4.0ln/ml3.02.01.0AltoBasso166 168 170 172 174 176 178 180 182giorni dal partoCTREXP* = P < 0.05

AltoBasso10Lisozima Latte*86420166 168 170 172 174 176 178 180 182CTREXPLisozima sangue8*642* = P < 0.050166 168 170 172 174 176 178 180 182CTR EXP

AltoBasso80NAGase latte* * *6040200166 168 170 172 174 176 178 180 182CTREXPNAGase sangue8006004002000166 168 170 172 174 176 178 180 182* = P < 0.05CTREXP

Rapporto NAGase latte / sangue0.16* *0.120.080.04AltoBasso0.00166 168 170 172 174 176 178 180 182CTREXP* = P < 0.05

Variazioni dell’amido (glucosio)i. Risposta produttiva (Latte)ii. Risposta endocrina (Cortisolo)iii. Risposta metabolica (NEFA b-OHB)iv. Generazione di uno stress ossidativo (riduzione GSH e GPx)v. Diversa attività di lisozima e NAGase nel sangue e latte e aumentodi SCCvi. Effetto più evidente con la riduzione di amido

Il problema delle tight-junctions

Struttura delle cellule epiteliali della ghiandolamammaria (Wilde, 2003)

Stress da isolamento e integrità delle tight-junction inbovine in lattazione sottoposte a challange conendotossine battericheMisura del lattosio nel sangue come indicatore di stress

Bovine con ALTA risposta allo stressBovine con BASSA risposta allo stressStelwagen et al., 2000Figure 1. Plasma lactose concentrations in cows previously selected for low (LC) or high (HC) stress-responsiveness.Stress was induced by isolating cows in a stanchion barn at –1 h, during which cows were subsequently challenged at 0h in one hind quarter with Escherichia coli endotoxin. Values are means ± SEM. Means that were not different (P >0.05) from baseline values are indicated by #.

Integrità delle tight-junctions, sistema plasminico nel sanguee nel latte e proteolisi delle Caseine (adattato da Wilde, 2003)Inizio lattazioneFine lattazione, con 3 mungitureFine lattazioneCondizioni di stress

Conta cellule somatiche nel latte e rapportocaseina/proteina (Coulon et al., 1998)Proteina, g/kg34333231aabcc83828180Caseina/Proteina, %3079800Conta cellule (x 1000/ml)ProteineCaseina/Proteine

Numero di lattazione e rapporto caseina/proteina(Coulon et al., 1998)Proteina, g/kg33323130a ab bc c1 2 3 4 5 6838281Caseina/Proteina, %Numero di lattazioneProteineCaseina/Proteine

Srinivasan and Lucey, 2002Figure 1. Effects of incubation of milk with plasmin on the percentage of intact (ƀ) β-casein and (•) αs-caseins. Values are means from replicates (n = 3).

Srinivasan and Lucey, 2002Figure 7. Confocal scanning laser micrographs of rennet-induced gels at 32°C of controlmilk (A), and milk incubated with plasmin for 1 (B), 2 (C), 3 (D), 4 (E), 6 (F), 7 (G), and8 h (H). Protein material is white, and dark areas are the pores. Scale bar = 50 µm.

Frequenza di MungituraStudio effettuato in 52 settimane dilattazione(Sorensen et al., 2001)

Milk quality: SCC7006005002X milked, low inputSCC4003003X milked, low input20010000 10 20 30 40 50 60Lactation week2X milked, high input3X milked, high input

Frequenza di mungitura e concentrazioni di sodio e potassio nel lattedurante la lattazione5040mmol/l302010010 20 30 40 50 60Settimane di lattazioneNa - 2M Na - 3M K - 2M K - 3M

Integrità delle tight-junctions e rapporto Sodio e PotassioNa/K ratio0.90.80.70.60.52x milked• L’integrità dell’epitelio è aumentata inseguito alla frequenza di mungitura …..• …. Meno plasmina è stata trasferita nellatte ….• ….la “caseolisi” è stata ridotta0.40.33x milked0.210 20 30 40 50 60Lactation week

Frequenza di Mungitura e proteina nel latte a 52settimane402 Mungiture 3 Mungiture353025ProteinaCaseinaNumero caseina (P< 0.05)80.077.575.072.570.02 Mungiture 3 Mungiture

Frequenza di Mungitura e sistema plasminico nel latte a52 settimane504030201002 Mungiture 3 Mungiture*Palsmina (P)*Plasminogeno (p)

Frequenza di Mungitura e frazioni caseiniche nel latte a52 settimane50*2 Mungiture 3 Mungiture40*302010* *0aCN bCN kCN gCN

Frequenza di Mungitura• Previene o migliora la qualità tecnologica del latte verso lafine della lattazione• Riduzione della plasmina, probabilmente per la riduzionedel tempo di stazione del latte in cisterna• Mantiene l’integrità delle giunzioni fra cellule epiteliali,riducendo il passaggio di enzimi proteolitici dal sangue allatte

Tipologia di allevamento, benessereanimale e qualità delle produzioni:Quale relazione ?

InterregIII A Phare CBCProgetto Italia – Slovenia 2000 / 2006Responsabile ScientificoBruno Stefanon

Enti coinvoltiPartner italiani- Dipartimento di Scienze Animali - Università di Udine- Associazione Allevatori FVGPartner sloveni- Dipartimento di Scienze Zootecniche - Università di Lubiana- Camera Agricoltura e Foreste Slovenia - Ente di Nova Goriza

Province di interesseIn Italia• Udine• Gorizia• TriesteIn Slovenia• Obalno-Kraska• Goriska

PrelieviAziendeItaliaSloveniaTotaleIntensive 6 7 13Biologiche 6 3 9Totale 12 10 22In ciascuna azienda sono state scelte 10 bovine nel postparto(max 60 gg dopo il parto)

Marcatori di benessereGPx e NOx ematici6050u/l; mmol/l403020100GPxNoxIntensivoBiologico

Metabolismo energeticoBOHB e NEFA ematici1.8*1.51.2*mmol/l0.90.60.30.0BOHBNEFAIntensivoBiologico* = P < 0.05

Latte di massaComposizione chimica ed igiene del latte di massa delleaziende italiane intensive e biologiche6543210% grasso % proteina %lattosiointensivobiologico

Latte di massaSCC e CBT nel latte15* *129ln630ln-SCCln-CBT* = P < 0.05IntensivoBiologico

Qualità del formaggio a 60 ggRisultati analisi sensoriale

Parametri olfattivi nei formaggi italiani e sloveni diproduzione intensiva e biologicaParametri olfattiviintensità6propionico4latte2fieno0acidostallaburroIntensivo IT Biologico IT Intensivo SL Biologico SL

Parametri gustativo-tattili nei formaggi italiani e sloveni diproduzione intensiva e biologicaParametri gustativo-tattilipastosoamaro64grassodolce20piccantesalatoacidoconsistenteelasticoIntensivo IT Biologico IT Intensivo SL Biologico SL

Parametri retrolfattivi nei formaggi italiani e sloveni diproduzione intensiva e biologicaParametri retrolfattivifienoburro6543210persistenzaburrolatteIntensivo IT Biologico IT Intensivo SL Biologico SL

Parametri qualitativi nei formaggi italiani e sloveni diproduzione intensiva e biologicaParametri qualitativiattraenza6543gradevollezza2qualitàpiacevolezzaIntensivo IT Biologico IT Intensivo SL Biologico SL

Non c’è bisogno che tutto l’universo s’armi per schiacciarlo:un vapore, una goccia d’acqua basta per ucciderloBlaise Pascal, Pensieri, fr. 347OvveroNon cade una goccia nell’oceano senza che tutto l’universosi commuova