i Éder Ricardo de Moraes Efeito diferencial do veneno do escorpião ...

Dos DRG obtidos foram removidos o excesso de tecido conjuntivo e as meninges, e
foram seccionados para expor seu interior durante o tratamento enzimático.
4.10. Dissociação:
Os DRG foram incubados a 37ºC em tubos de centrifugação de 15 mL contendo 3mL
da Solução Enzimática 1 por 20 min, gentilmente agitados a cada 5 min. Foram
centrifugados por 30 segundos e o sobrenadante foi descartado.
A Solução Enzimática 2 foi adicionada e o procedimento de incubação e
centrifugação foi repetido.
Quando o tratamento enzimático estava completo, o meio de cultura F12 contendo
10% soro fetal bovino foi adicionado para interromper a ação enzimática. O processo
de centrifugação foi realizado e o sobrenadante descartado. Um mL de F12 foi
acrescentado e os DRG foram submetidos à trituração mecânica realizada com
pipetas de vidro com as pontas polidas em fogo com diâmetro interno final em torno
de 2 mm.
Após a trituração mecânica, o meio de cultura encontrava-se repleto de corpos
celulares neuronais em suspensão. Esses neurônios foram transferidos para as
placas de vidro previamente cobertas com poli-L-lisina e posteriormente com
laminina. Para permitir a adesão dos neurônios aos discos de vidro, estes foram
colocados em estufa (37°C, 5% CO2, 100% de umidade) por no mínimo 2 horas.
Após as 2 h de repouso para adesão celular, foi adicionado meio de cultura L15 para
nutrir os neurônios.
4.11. Manutenção dos neurônios:
Os neurônios foram mantidos com meio de cultura L15, permanecendo em
temperatura ambiente por 24 horas, para que se tornassem viáveis para os registros
eletrofisiológicos. Os neurônios foram utilizados dentro de 72 horas após o seu
isolamento.
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