Tese de Mestrado - Isabella versao final corrigida - UFF

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histoquímica, zimografia, PCR e western blot e os linfonodos braquial e axilar para citometria de fluxo. 3.3 Processamento histológico Para o processamento histológico os músculos foram fixados durante 24 horas em formol tamponado Milloning a 10% pH 7,2. Os tecidos foram desidratados em soluções com concentração crescente de álcool etílico (70%, 80%, 90%) num período de 60 minutos cada, passados 3 vezes em álcool absoluto e 3 vezes em Xilol (Reagen). A impregnação e inclusão em parafina (paraplast, Sigma, USA) foi efetuada em duas incubações durante 1 hora a 60 °C. Os músculos foram clivados e incluídos transversalmente com as porções centrais do fragmento posicionadas mais externamente no bloco. Foram feitos em média 10 cortes de 5µm de espessura no micrótomo Spencer 820 (American Optical, EUA) após chegar no nível da lesão muscular. Os cortes foram colocados em lâminas de microscopia desengorduradas e previamente filmadas com solução de glicerol-albumina (0,5%), mantidos em estufa a 37°C durante 12 horas e submetidos às colorações histológicas de hematoxilia- eosina (HE), Picrosírius e Giemsa. 3.4 Imuno-histoquímica O músculo T. brachii foi cuidadosamente removido, congelado em nitrogênio líquido e incluído em OCT (Sakura, EUA). Cortes de 5 µm de espessura foram colocados em lâminas desengorduradas e previamente filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chem. Co, Mo, EUA). Após a fixação por 10 30
minutos em acetona a -20°C, os cortes foram mergulhados em solução de salina-fosfato tamponada (PBS pH 7,2) por 5 minutos. A inibição da peroxidase endógena foi feita com 3% peróxido de hidrogênio (Merck do Brasil) por 30 minutos. Os cortes foram hidratados com PBS por 5 minutos e, posteriormente feito o bloqueio de antígenos inespecíficos incubando com PBS contendo 2% de albumina bovina (BSA fração V, Sigma Chem. Co., EUA) durante 30 minutos a 37°C. A seguir os cortes foram incubados com os anticorpos primários diluídos em PBS (30µl) por 1 hora a 37° C (ver tabela 1). Após três lavagens sucessivas de 5 minutos com PBS, os cortes foram incubados em câmara úmida com anticorpo secundário apropriado diluído em PBS (30µl) por uma hora à temperatura ambiente. Após novas lavagens com tampão PBS, a revelação da peroxidase foi feita com aminoetilcarbazol (AEC, Sigma Chem. Co., EUA) na presença de 3% de peróxido de hidrogênio (Merck do Brasil). Todos os cortes foram contra-corados suavemente com hematoxilina de Mayer por 2 minutos e montados em meio de montagem a base de gelatina. Tabela 1: Relação dos anticorpos monoclonais utilizados na imuno-histoquímica. Anti-CD4.biotina rato Caltag 1/80 Anti-CD8.biotina rato Caltag 1/80 Anti-F4-80 rato Serotec 1/40 Anti-Mac-1.biotina rato Pharmingen 1/30 Anticorpos monoclonais Origem Fonte Diluição 31
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