Tese de Mestrado - Isabella versao final corrigida - UFF

centrifugadas novamente a 14.000 xg por 20 minutos a 4°C. O pellet foi lavado
com 600µl de etanol gelado a 70% e submetido à nova centrifugação de 14.000
xg por 15 minutos a 4°C. O RNA foi dissolvido em 15 µl de H2O livre de RNAse
e estocado a -70°C.
3.7.2 Eletroforese de RNA
Após a extração do RNA total, a sua integridade foi verificada em gel
desnaturante de agarose-formaldeído 1,2%. A amostra de RNA (5µl) foi diluída
em 10µl de formamida (Merck do Brasil), 4µl de tampão MOPS 5X (Invitrogen,
Brasil), 1,3µl de 37% formaldeído (Merck do Brasil), 1µl de (1µl/ml) brometo de
etídio (Sigma Chem. Co., EUA) e 1µl de azul de bromofenol (Merck do Brasil),
seguido de incubação por 10 minutos a 65°C. A mistu ra foi mantida no gelo até
sua aplicação no gel. A corrida de eletroforese foi feita a 75V por 1 hora em
cuba horizontal (Kodak, EUA). A integridade do RNA foi avaliada no
transiluminador de luz ultravioleta observando-se a integridade das bandas de
RNA ribossomal de 17 e 28S. A pureza e a concentração do RNA extraído foi
determinada através de leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda
260 e 280nm. Considerando-se que 1 unidade de DO260 equivale a 40 μg/mL
de RNA, foi realizado o cálculo da razão entre a DO em 260 e 280nm para
estimar o grau de pureza do RNA total. Somente foi utilizado RNA com a razão
entre 1,6 e 2,0.
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